Las modificaciones post-transcripcionales del ARN representan una capa poco estudiada de regulación de la traducción que recientemente se ha relacionado con la plasticidad del sistema nervioso central. Aquí, se describe la preparación de muestras y el enfoque de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem para la caracterización simultánea de numerosas modificaciones de ARN en neuronas individuales.
Las modificaciones post-transcripcionales (PTM) del ARN representan un mecanismo poco estudiado involucrado en la regulación de la traducción en el sistema nervioso central (SNC). La evidencia reciente ha relacionado modificaciones específicas del ARN neuronal con paradigmas de aprendizaje y memoria. Desafortunadamente, los métodos convencionales para la detección de estas características epitranscriptómicas solo son capaces de caracterizar modificaciones de ARN altamente abundantes en tejidos a granel, lo que impide la evaluación de perfiles únicos de PTM que pueden existir para neuronas individuales dentro de los circuitos conductuales activados. En este protocolo, se describe un enfoque, el análisis de modificación de ARN de una sola neurona por espectrometría de masas (SNRMA-MS), para detectar y cuantificar simultáneamente numerosos ribonucleósidos modificados en neuronas individuales. El enfoque se valida utilizando neuronas individuales del molusco marino, Aplysia californica, comenzando con el aislamiento quirúrgico y el tratamiento enzimático de los principales ganglios del SNC para exponer los cuerpos celulares de las neuronas, seguido por el aislamiento manual de una sola neurona utilizando agujas afiladas y una micropipeta. A continuación, se realiza un tratamiento mecánico y térmico de la muestra en un pequeño volumen de tampón para liberar ARN de una célula individual para la posterior digestión del ARN. Los nucleósidos modificados se identifican y cuantifican utilizando un método optimizado de cromatografía líquida-espectrometría de masas. SNRMA-MS se emplea para establecer patrones de modificación de ARN para neuronas individuales e identificadas de A. californica que tienen morfologías y funciones conocidas. Se presentan ejemplos de SNRMA-MS cualitativos y cuantitativos que destacan la distribución heterogénea de las modificaciones de ARN a través de neuronas individuales en redes neuronales.
Las modificaciones en los nucleósidos canónicos del ARN han sido cada vez más reconocidas por sus innumerables funciones en la regulación de la traducción de proteínas. Hasta la fecha se han reportado más de 150 modificaciones únicas de ARN que varían en complejidad desde la metilación, la adición de heteroátomos hasta la conjugación con metabolitos celulares 1,2. Este alfabeto de ARN expandido, también conocido como epitranscriptome, es generado por escritores enzimáticos y es responsable de alterar la estabilidad3, el plegado4 y la eficiencia de traducción 5,6 de los ARN celulares. Las modificaciones seleccionadas de ARN también pueden revertirse a través de borradores enzimáticos 7,8, mientras que otras se agregan a los ARN subestoquiométricamente 9,10, lo que representa un panorama complejo de secuencias de ARN modificadas y no modificadas en sistemas biológicos.
La importancia de las modificaciones del ARN en la función biológica está indicada por la distribución desigual de las modificaciones entre los diferentes órganos y tejidos, incluidas las subregiones del sistema nervioso central (SNC)11. Esta heterogeneidad química se ha relacionado con el desarrollo del SNC12, la respuesta al estrés13 y la plasticidad dependiente de la actividad14. Las subregiones del SNC comprenden además poblaciones heterogéneas de células en las que las células individuales exhiben perfiles químicos distintos 15,16,17,18. Incluso las células individuales del mismo tipo pueden mostrar transcriptomas únicos, en parte debido a los microambientes tisulares19 y la expresión génica estocástica20. Sin embargo, aunque la caracterización del transcriptoma unicelular es algo rutinaria, no existen métodos análogos para establecer epitranscriptomas unicelulares para múltiples modificaciones de ARN. Se necesitan nuevos enfoques que sean capaces de perfilar la distribución de las modificaciones del ARN en células individuales para un análisis exhaustivo de la heterogeneidad celular y la influencia reguladora de las modificaciones post-transcripcionales (PTM) en el SNC y otros sistemas biológicos.
La medición simultánea de numerosas modificaciones de ARN en células / tejidos a granel se logra fácilmente utilizando técnicas de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS / MS). Para el análisis LC-MS/MS de ribonucleósidos modificados, el ARN se extrae de las células (típicamente 103-10 6 células), se purifica por precipitación y resuspensión, y posteriormente se digiere en nucleósidos. La mezcla de muestra que consiste en nucleósidos canónicos y modificados se inyecta en el sistema LC-MS para la separación y detección de analitos, lo que lleva a la determinación del complemento completo de modificaciones de ARN en un organismo 21,22,23. LC-MS/MS se utilizó recientemente para determinar 26 modificaciones de ARN en el SNC del modelo neurobiológico, Aplysia californica (A. californica). Las abundancias de algunas de estas marcas epitranscriptómicas exhibieron dinámicas dependientes del tiempo y la región que se correlacionaron con cambios de comportamiento en el animal24. Sin embargo, solo fue posible detectar modificaciones de ARN en muestras a granel que contenían >103 células debido a la sensibilidad limitada del método. Estas muestras más grandes probablemente ocultaron perfiles de modificación de ARN únicos y funcionalmente importantes de células individuales con promedios poblacionales. Aunque el control cuidadoso de las condiciones de preparación de muestras ha mejorado los límites de detección de modificaciones de ARN en muestras de pequeño volumen 25,26,27,28, sigue siendo necesario métodos analíticos que puedan detectar y cuantificar múltiples ribonucleósidos modificados en células individuales.
Este protocolo introduce el análisis de modificación de ARN de una sola neurona por espectrometría de masas (SNRMA-MS), que permite la detección de más de una docena de modificaciones de ARN en neuronas individuales del SNC de A. californica29. El enfoque consiste en el aislamiento quirúrgico de células individuales identificadas de los principales ganglios del SNC, seguido de un flujo de trabajo optimizado de preparación de muestras que involucra lisis celular mecánica, desnaturalización de ARN e hidrólisis enzimática en un tampón compatible con EM. La identificación y cuantificación de nucleósidos modificados post-transcripcionalmente se logra utilizando LC-MS / MS. SNRMA-MS satisface una necesidad insatisfecha en el campo del análisis de modificación de ARN al facilitar la adquisición de perfiles de modificación de ARN post-transcripcionales para neuronas individuales y tiene potencial para su aplicación futura a otros tipos de células.
SNRMA-MS aprovecha un enfoque optimizado de preparación de muestras, lo que resulta en un volumen de muestra pequeño y compatible con MS que se puede entregar a la plataforma LC-MS. El pretratamiento enzimático inicial de los ganglios del SNC dicta tanto la facilidad con la que se pueden desenvainar como la durabilidad de las neuronas individuales durante el aislamiento. El ganglio cerebral a menudo requiere un tratamiento enzimático prolongado debido a su vaina relativamente gruesa en comparación con los ganglios bucales, pleurales y abdominales. Los investigadores individuales que realizan los aislamientos de una sola neurona pueden tener diferentes preferencias sobre qué tan duradera debe ser la vaina cuando se usan microescisores y fórceps finos. Sin embargo, es importante que los ganglios no se digieran en exceso, ya que esto puede conducir a una pérdida en su integridad estructural, pérdida de información posicional que es crítica para identificar las células diana y / o lisis celular. Después del aislamiento del ganglio, es importante asegurarse de que se aspire un volumen mínimo de medio de aislamiento al transferir la neurona al tubo de muestra. El medio ASW contiene una alta concentración de sales que pueden interferir con las enzimas digestivas durante la hidrólisis de ARN y también diluirá la muestra.
Durante la etapa de lisis mecánica, es común que las neuronas grandes (>250 μm de diámetro) se rompan al pasar repetidamente a través de una micropipeta. Las neuronas más pequeñas pueden requerir atención adicional para garantizar la lisis celular, que generalmente implica presionar un capilar de vidrio en la célula. En este caso, es posible que un volumen parcial del tampón de la muestra se extraiga hacia el capilar debido a las fuerzas capilares. Este volumen se puede devolver al tubo de muestra aplicando presión en el extremo del capilar de vidrio para garantizar que no se pierda ninguna muestra.
Los mejores resultados se obtienen incluyendo un paso de calentamiento antes de agregar enzimas para la digestión del ARN. Esto es probable porque el calentamiento a 95 °C desnaturaliza las estructuras secundarias de ARN que pueden impedir la actividad de las RNasas35 y disminuir la cantidad de nucleósidos liberados de los biopolímeros de ARN. Los experimentos de control utilizando muestras con picos de metionina marcada con isótopos estables se realizaron previamente para investigar si los artefactos de modificación de ARN inducidos por calor fueron la causa del aumento de las áreas de pico observadas para las modificaciones de ARN en relación con un protocolo SNRMA-MS sin calor29. No se observó tal etiquetado, lo que indica que las señales mejoradas para las modificaciones de ARN utilizando el método optimizado SNRMA-MS se debieron a una digestión superior del ARN.
Los métodos convencionales para aislar el ARN total de las células implican la extracción líquido-líquido (LLE) con fenol-cloroformo y la posterior precipitación, lavado y resuspensión de ARN. Estos enfoques han demostrado ser útiles para experimentos de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa donde la expresión de genes seleccionados puede ser fácilmente monitoreada en neuronas A. californica identificadas 36,37. Sin embargo, los métodos LLE no pueden recuperar suficiente ARN para la detección de ribonucleósidos modificados por LC-MS, mientras que el método SNRMA-MS descrito aquí permite la detección de numerosas modificaciones de ARN29. Con el fin de evaluar los perfiles de modificación de tipos específicos de ARN (por ejemplo, ARNr, ARNt, ARNm) en muestras de tejido/célula a granel, se han aplicado24 la extracción en fase sólida de intercambio aniónico, el enriquecimiento basado en sonda de hibridación38 y el fraccionamiento cromatográfico39, pero aún no se dispone de métodos similares para la purificación del ARN unicelular. El desarrollo de enfoques de fraccionamiento de ARN que son capaces de aislar tipos específicos de ARN de células individuales proporcionaría información adicional sobre la función de las modificaciones de ARN.
SNRMA-MS reveló heterogeneidad previamente no caracterizada en el panorama de modificación de ARN de neuronas individuales en A. californica y es concebible que existan perfiles ptM igualmente distintos en las células de mamíferos. Debido a que las células de mamíferos son relativamente pequeñas en comparación con las grandes neuronas de A. californica analizadas en este protocolo, se necesitan mejoras en el manejo de pequeños volúmenes de muestra para facilitar los límites de detección más bajos. Aunque actualmente SNRMA-MS está limitado a volúmenes de ~ 5 μL, se espera que se puedan lograr mejoras sustanciales mediante la incorporación de dispositivos de manejo de líquidos microfluídicos en el flujo de trabajo. Además, la implementación de aislamientos celulares automatizados o semiautomatizados aumentaría el rendimiento de la muestra y permitiría el análisis de modificación de ARN unicelular de poblaciones celulares más grandes. Al interactuar con las separaciones LC de nanoflujo27, se podrá lograr la caracterización de las marcas epitranscriptómicas en células aún más pequeñas.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas bajo el Premio No. P30DA018310 y el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano bajo el Premio no. RM1HG010023. K.D.C. reconoce el apoyo de una beca postdoctoral del Instituto Beckman. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de las agencias de financiación.
Animals | |||
Aplysia californica | National Resource for Aplysia (Miami, FL) | 150–250 g (adult) | |
Benchtop equipment | |||
Glass capillary puller | Sutter | P-97 | Equipped with online degasser, autosampler, and thermostatted column compartment |
Milli-Q water purification system | Millipore | Equipped with ESI source | |
Minicentrifuge for PCR tubes | LW Scientific | ZS-1 | |
Optical Microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
Thermocycler | Techne | EW-93945-01 | |
HPLC column and consumables | |||
Acclaim RSLC 120 C18 column | Thermo Scientific | 71399 | |
Autosampler vials | Thermo Scientific | C4011-13 | |
LC and MS Instrumentation and Software | |||
DataAnalysis 4.4 software | Bruker | ||
Dionex Ultimate 3000 nanoLC | Thermo Scientific | ||
Impact HD UHR QqTOF mass spectrometer | Bruker | ||
RStudio | RStudio | ||
Microdissection tools | |||
Microscissors extra fine vannas 3.5” | Roboz | RS-5640 | |
Tungsten needles | Roboz | RS-6065 | |
Reagents/Materials | |||
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane-sulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | H3375 | |
Alkaline phosphatase | Worthington Biochemical Corp. | LS004081 | |
Ammonium acetate | Honeywell | 17836 | |
benzonase (endonuclease from S. marcescens) | EMD Millipore | 70746-4 | |
bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
gentamycin sulfate | Fisher Scientific | G1264 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 208094 | |
nucleosides test mix | Sigma-Aldrich | 47310-U | |
penicillin G | Sigma-Aldrich | P7794 | |
pentostatin | Sigma-Aldrich | SML0508 | |
phosphodiesterase I | Worthington Biochemical Corp. | LS003926 | |
protease type XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Standard glass capillaries | A-M Systems | 626000 | 1 mm o.d., 0.5 mm i.d., 4 in |
streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 |