Posttranskripsjonelle modifikasjoner av RNA representerer et undervurdert lag av oversettelsesregulering som nylig har vært knyttet til plastisitet i sentralnervesystemet. Her er prøvepreparering og flytende kromatografi-tandem massespektrometri tilnærming beskrevet for samtidig karakterisering av mange RNA-modifikasjoner i enkelte nevroner.
Posttranskripsjonelle modifikasjoner (PTMer) av RNA representerer en undervurdert mekanisme involvert i regulering av oversettelse i sentralnervesystemet (CNS). Nyere bevis har knyttet spesifikke nevronale RNA-modifikasjoner til læring og minneparadigmer. Dessverre er konvensjonelle metoder for påvisning av disse epitranskriptomiske egenskapene bare i stand til å karakterisere svært rikelige RNA-modifikasjoner i bulkvev, og utelukker vurderingen av unike PTM-profiler som kan eksistere for individuelle nevroner innenfor de aktiverte atferdskretsene. I denne protokollen beskrives en tilnærming – en-nevron RNA-modifikasjonsanalyse ved massespektrometri (SNRMA-MS) – for samtidig å oppdage og kvantifisere mange modifiserte ribonukleotider i enkeltnevroner. Tilnærmingen er validert ved hjelp av individuelle nevroner av den marine mollusk, Aplysia californica, som begynner med kirurgisk isolasjon og enzymatisk behandling av store CNS ganglia for å eksponere nevroncellelegemer, etterfulgt av manuell enkelt-neuron isolasjon ved hjelp av skarpe nåler og en mikropipette. Deretter gjøres mekanisk og termisk behandling av prøven i et lite volum buffer for å frigjøre RNA fra en individuell celle for etterfølgende RNA-fordøyelse. Modifiserte nukleosider identifiseres og kvantifiseres deretter ved hjelp av en optimalisert væskekromatografi-massespektrometrimetode. SNRMA-MS brukes til å etablere RNA-modifikasjonsmønstre for enkeltstående, identifiserte nevroner fra A. californica som har kjente morfologier og funksjoner. Eksempler på kvalitativ og kvantitativ SNRMA-MS presenteres som fremhever den heterogene fordelingen av RNA-modifikasjoner på tvers av individuelle nevroner i nevronnettverk.
Modifikasjoner i kanoniske nukleosider av RNA har blitt stadig mer anerkjent for sine utallige roller i reguleringen av proteinoversettelse. Over 150 unike RNA modifikasjoner har blitt rapportert til dags dato som spenner i kompleksitet fra metylering, heteroatom tillegg, til konjugering med cellulære metabolitter 1,2. Dette utvidede RNA-alfabetet, også kjent som epitranscriptomet, genereres av enzymatiske forfattere og er ansvarlig for å endre stabiliteten3, folde4 og oversettelseseffektivitet 5,6 av cellulære RNAer. Utvalgte RNA-modifikasjoner kan også reverseres via enzymatiske viskelær 7,8, mens andre legges til RNAs substoichiometrisk 9,10, noe som gjør et komplekst landskap av modifiserte og umodifiserte RNA-sekvenser i biologiske systemer.
Betydningen av RNA-modifikasjoner i biologisk funksjon er indikert ved ulik fordeling av modifikasjoner på tvers av forskjellige organer og vev, inkludert underregioner i sentralnervesystemet (CNS)11. Denne kjemiske heterogeniteten har vært knyttet til CNS-utvikling12, stressrespons13 og aktivitetsavhengig plastisitet14. CNS-underregionene består videre av heterogene populasjoner av celler der individuelle celler viser distinkte kjemiske profiler 15,16,17,18. Selv enkeltceller av samme type kan vise unike transkripsjoner, delvis på grunn av vevsmikromiljøet19 og stokastisk genuttrykk20. Selv om karakterisering av encellet transkripsjon er noe rutinemessig, er det imidlertid ingen analoge metoder for å etablere encellede epitranskriptomer for flere RNA-modifikasjoner. Nye tilnærminger som er i stand til å profilere fordelingen av RNA-modifikasjoner i individuelle celler er nødvendig for omfattende analyse av cellulær heterogenitet og regulatorisk påvirkning av posttranskripsjonelle modifikasjoner (PTMer) i CNS og andre biologiske systemer.
Samtidig måling av mange RNA-modifikasjoner i bulkceller/vev oppnås enkelt ved hjelp av flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) teknikker. For LC-MS/MS-analyse av modifiserte ribonukleosider ekstraheres RNA fra celler (vanligvis 103-10 6 celler), renset av nedbør og resuspensjon, og deretter fordøyes i nukleosider. Prøveblandingen som består av kanoniske og modifiserte nukleosider injiseres deretter i LC-MS-systemet for analyttseparasjon og deteksjon, noe som fører til bestemmelse av hele komplementet av RNA-modifikasjoner i en organisme 21,22,23. LC-MS/MS ble nylig brukt til å bestemme 26 RNA-modifikasjoner i CNS i den nevrobiologiske modellen Aplysia californica (A. californica). Overfloden av noen av disse epitranscriptomiske merkene viste tids- og regionavhengig dynamikk som korrelerte med atferdsendringer i dyret24. Det var imidlertid bare mulig å oppdage RNA-modifikasjoner i bulkprøver som inneholder > 103 celler på grunn av metodens begrensede følsomhet. Disse større prøvene skjulte sannsynligvis unike og funksjonelt viktige RNA-modifikasjonsprofiler av individuelle celler med befolkningsgjennomsnitt. Selv om nøye kontroll av prøveprepareringsforholdene har forbedret deteksjonsgrensene for RNA-modifikasjoner i små volumprøver 25,26,27,28, er det fortsatt behov for analytiske metoder som kan oppdage og kvantifisere flere modifiserte ribonukleotider i enkeltceller.
Denne protokollen introduserer en-neuron RNA modifikasjon analyse av masse spektrometri (SNRMA-MS), som tillater påvisning av over et dusin RNA modifikasjoner i enkelt nevroner fra CNS av A. californica29. Tilnærmingen består av kirurgisk isolasjon av enkeltstående, identifiserte celler fra store CNS ganglia etterfulgt av en optimalisert prøveprepareringsarbeidsflyt som involverer mekanisk cellelyse, RNA-denaturering og enzymatisk hydrolyse i en MS-kompatibel buffer. Identifisering og kvantifisering av posttranskripsjonsmodifiserte nukleosider oppnås deretter ved hjelp av LC-MS/MS. SNRMA-MS oppfyller et udekket behov innen RNA-modifikasjonsanalyse ved å legge til rette for anskaffelse av posttranskripsjonelle RNA-modifikasjonsprofiler for enkeltnevroner og har potensial for fremtidig anvendelse på andre celletyper.
SNRMA-MS bruker en optimalisert prøveforberedelsestilnærming, noe som resulterer i et lite, MS-kompatibelt eksempelvolum som kan leveres til LC-MS-plattformen. Den første enzymatiske forbehandlingen av CNS ganglia dikterer både hvor enkelt de kan desheathed og holdbarheten til enkeltnevroner under isolasjon. Cerebral ganglion krever ofte utvidet enzymatisk behandling på grunn av sin relativt tykke kappe sammenlignet med bukkal, pleural og abdominal ganglia. Individuelle forskere som utfører de enkle nevronisolasjonene kan ha forskjellige preferanser for hvor holdbar kappen skal være når man bruker mikroscissorer og fine tang. Det er imidlertid viktig at ganglia ikke er overfordøyd, da dette kan føre til tap av strukturell integritet, tap av posisjonsinformasjon som er kritisk for å identifisere målceller, og / eller cellelys. Etter isolasjon fra ganglion er det viktig å sikre at et minimalt volum isolasjonsmedium aspireres når du overfører nevronen til prøverøret. ASW-mediet inneholder en høy konsentrasjon av salter som kan forstyrre fordøyelsesenzymer under RNA hydrolyse og vil også fortynne prøven.
Under det mekaniske lysistrinnet er det vanlig at store nevroner (>250 μm diameter) brister ved gjentatte ganger å passere gjennom en mikropipette. Mindre nevroner kan kreve ekstra oppmerksomhet for å sikre cellelys, noe som vanligvis innebærer å trykke på en glasskapillær på cellen. I dette tilfellet er det mulig at et delvis volum av prøvebufferen vil bli trukket inn i kapillæren på grunn av kapillære krefter. Dette volumet kan leveres tilbake i prøverøret ved å trykke på enden av glasskapillæren for å sikre at ingen prøve går tapt.
De beste resultatene oppnås ved å inkludere et oppvarmingstrinn før du legger til enzymer for RNA-fordøyelsen. Dette skyldes sannsynligvis oppvarming ved 95 °C denaturer RNA sekundære strukturer som kan hindre aktiviteten til RNases35 og redusere mengden nukleosider frigjort fra RNA biopolymerer. Kontrolleksperimenter med prøver med stabil isotopmerket metionin ble tidligere utført for å undersøke om varmeinduserte RNA-modifikasjonsartefakter var årsaken til de økte toppområdene som ble observert for RNA-modifikasjoner i forhold til en SNRMA-MS-protokolluten varme 29. Ingen slik merking ble observert, noe som indikerer at de forbedrede signalene for RNA-modifikasjoner ved hjelp av den optimaliserte SNRMA-MS-metoden skyldtes overlegen fordøyelse av RNA.
Konvensjonelle metoder for å isolere total RNA fra celler innebærer væske-væske utvinning (LLE) med fenol-kloroform og påfølgende RNA nedbør, vask og resuspension. Disse tilnærmingene har vist seg nyttige for omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjonseksperimenter der uttrykket av utvalgte gener lett kan overvåkes i identifiserte A. californica nevroner 36,37. LLE-metoder kan imidlertid ikke gjenopprette tilstrekkelig RNA for påvisning av modifiserte ribonukleotider av LC-MS, mens SNRMA-MS-metoden som er beskrevet her, muliggjør deteksjon av mange RNA-modifikasjoner29. For å vurdere modifikasjonsprofiler av spesifikke RNA-typer (f.eks. rRNA, tRNA, mRNA) i bulkvevs-/celleprøver, anionutveksling av fastfaseutvinning24, hybridiseringssondebasert berikelse38 og kromatografisk fraksjonering39 tilnærminger er brukt, men lignende metoder er ennå ikke tilgjengelige for encellet RNA-rensing. Utviklingen av RNA-fraksjoneringsmetoder som er i stand til å isolere spesifikke RNA-typer fra enkeltceller, vil gi ytterligere innsikt i funksjonen til RNA-modifikasjoner.
SNRMA-MS avslørte tidligere ukarakterisert heterogenitet i RNA-modifikasjonslandskapet til enkeltnevroner i A. californica , og det kan tenkes at tilsvarende distinkte PTM-profiler eksisterer på tvers av pattedyrceller. Fordi pattedyrceller er relativt små sammenlignet med de store A. californica-nevronene som analyseres i denne protokollen, er det nødvendig med forbedringer i håndteringen av små prøvevolumer for å lette lavere deteksjonsgrenser. Selv om SNRMA-MS for tiden er begrenset til volumer på ~ 5 μL, forventes det at betydelige forbedringer kan oppnås ved å innlemme mikrofluidiske væskehåndteringsenheter i arbeidsflyten. Videre vil implementeringen av automatiserte eller halvautomatiske celleisolasjoner øke prøvegjennomstrømningen og tillate encellet RNA-modifikasjonsanalyse av større cellepopulasjoner. Ved å interfacing med nanoflow LC separasjoner27, karakterisering av epitranscriptomiske merker i enda mindre celler vil være oppnåelig.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av National Institute on Drug Abuse under Award no. P30DA018310 og National Human Genome Research Institute under Pris nr. RM1HG010023. K.D.C. anerkjenner støtte fra et Beckman Institute Postdoctoral Fellowship. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til finansieringsbyråene.
Animals | |||
Aplysia californica | National Resource for Aplysia (Miami, FL) | 150–250 g (adult) | |
Benchtop equipment | |||
Glass capillary puller | Sutter | P-97 | Equipped with online degasser, autosampler, and thermostatted column compartment |
Milli-Q water purification system | Millipore | Equipped with ESI source | |
Minicentrifuge for PCR tubes | LW Scientific | ZS-1 | |
Optical Microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
Thermocycler | Techne | EW-93945-01 | |
HPLC column and consumables | |||
Acclaim RSLC 120 C18 column | Thermo Scientific | 71399 | |
Autosampler vials | Thermo Scientific | C4011-13 | |
LC and MS Instrumentation and Software | |||
DataAnalysis 4.4 software | Bruker | ||
Dionex Ultimate 3000 nanoLC | Thermo Scientific | ||
Impact HD UHR QqTOF mass spectrometer | Bruker | ||
RStudio | RStudio | ||
Microdissection tools | |||
Microscissors extra fine vannas 3.5” | Roboz | RS-5640 | |
Tungsten needles | Roboz | RS-6065 | |
Reagents/Materials | |||
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane-sulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | H3375 | |
Alkaline phosphatase | Worthington Biochemical Corp. | LS004081 | |
Ammonium acetate | Honeywell | 17836 | |
benzonase (endonuclease from S. marcescens) | EMD Millipore | 70746-4 | |
bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
gentamycin sulfate | Fisher Scientific | G1264 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 208094 | |
nucleosides test mix | Sigma-Aldrich | 47310-U | |
penicillin G | Sigma-Aldrich | P7794 | |
pentostatin | Sigma-Aldrich | SML0508 | |
phosphodiesterase I | Worthington Biochemical Corp. | LS003926 | |
protease type XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Standard glass capillaries | A-M Systems | 626000 | 1 mm o.d., 0.5 mm i.d., 4 in |
streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 |