Post-transkriptionelle modifikationer af RNA repræsenterer et understuderet lag af translationsregulering, der for nylig er blevet forbundet med centralnervesystemets plasticitet. Her beskrives prøveforberedelse og væskekromatografi-tandem massespektrometri tilgang til samtidig karakterisering af talrige RNA-modifikationer i enkelte neuroner.
Post-transkriptionelle modifikationer (PTM’er) af RNA repræsenterer en understuderet mekanisme involveret i reguleringen af translation i centralnervesystemet (CNS). Nylige beviser har knyttet specifikke neuronale RNA-modifikationer til lærings- og hukommelsesparadigmer. Desværre er konventionelle metoder til påvisning af disse epitranscriptomiske egenskaber kun i stand til at karakterisere meget rigelige RNA-modifikationer i bulkvæv, hvilket udelukker vurderingen af unikke PTM-profiler, der kan eksistere for individuelle neuroner inden for de aktiverede adfærdskredsløb. I denne protokol beskrives en tilgang – enkelt-neuron RNA-modifikationsanalyse ved massespektrometri (SNRMA-MS) – for samtidig at detektere og kvantificere adskillige modificerede ribonukleosider i enkelte neuroner. Fremgangsmåden valideres ved hjælp af individuelle neuroner i den marine bløddyr, Aplysia californica, begyndende med kirurgisk isolering og enzymatisk behandling af større CNS-ganglier for at udsætte neuroncellelegemer efterfulgt af manuel enkelt-neuronisolering ved hjælp af skarpe nåle og en mikropipette. Dernæst udføres mekanisk og termisk behandling af prøven i et lille volumen buffer for at frigøre RNA fra en individuel celle til efterfølgende RNA-fordøjelse. Modificerede nukleosider identificeres og kvantificeres derefter ved hjælp af en optimeret væskekromatografi-massespektrometrimetode. SNRMA-MS anvendes til at etablere RNA-modifikationsmønstre for enkelte, identificerede neuroner fra A. californica , der har kendte morfologier og funktioner. Eksempler på kvalitativ og kvantitativ SNRMA-MS præsenteres, der fremhæver den heterogene fordeling af RNA-modifikationer på tværs af individuelle neuroner i neuronale netværk.
Modifikationer i de kanoniske nukleosider af RNA er i stigende grad blevet anerkendt for deres utallige roller i reguleringen af proteintransformation. Over 150 unikke RNA-modifikationer er blevet rapporteret til dato, der spænder i kompleksitet fra methylering, heteroatom tilsætning til konjugation med cellulære metabolitter 1,2. Dette udvidede RNA-alfabet, også kendt som epitranscriptomet, genereres af enzymatiske forfattere og er ansvarlig for at ændre stabiliteten3, foldning4 og oversættelseseffektivitet 5,6 af cellulære RNA’er. Udvalgte RNA-modifikationer kan også vendes via enzymatiske viskelædere 7,8, mens andre er tilføjet til RNA’er substoichiometrisk 9,10, hvilket giver et komplekst landskab af modificerede og umodificerede RNA-sekvenser i biologiske systemer.
Betydningen af RNA-modifikationer i biologisk funktion er indikeret ved den ulige fordeling af modifikationer på tværs af forskellige organer og væv, herunder underregioner i centralnervesystemet (CNS)11. Denne kemiske heterogenitet har været forbundet med CNS-udvikling12, stressrespons13 og aktivitetsafhængig plasticitet14. CNS-underregionerne omfatter yderligere heterogene populationer af celler, hvor individuelle celler udviser forskellige kemiske profiler 15,16,17,18. Selv enkeltceller af samme type kan vise unikke transkriptomer, delvis på grund af vævsmikromiljøer19 og stokastisk genekspression20. Mens karakterisering af enkeltcelletransskriptomet er noget rutinemæssigt, er der imidlertid ingen analoge metoder til etablering af enkeltcelleepitranscriptomer til flere RNA-modifikationer. Nye tilgange, der er i stand til at profilere fordelingen af RNA-modifikationer i individuelle celler, er nødvendige for omfattende analyse af den cellulære heterogenitet og regulatoriske indflydelse af post-transkriptionelle modifikationer (PTM’er) i CNS og andre biologiske systemer.
Samtidig måling af talrige RNA-modifikationer i bulkceller / væv udføres let ved hjælp af væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) teknikker. Til LC-MS/MS-analyse af modificerede ribonukleosider ekstraheres RNA fra celler (typisk 103-10 6 celler), renses ved udfældning og resuspension og fordøjes efterfølgende til nukleosider. Prøveblandingen bestående af kanoniske og modificerede nukleosider injiceres derefter i LC-MS-systemet til analytseparation og påvisning, hvilket fører til bestemmelse af det fulde komplement af RNA-modifikationer i en organisme 21,22,23. LC-MS/MS blev for nylig brugt til at bestemme 26 RNA-modifikationer i CNS i den neurobiologiske model, Aplysia californica (A. californica). Overfloden af nogle af disse epitranscriptomiske mærker udviste tids- og regionsafhængig dynamik, der korrelerede med adfærdsændringer hos dyret24. Det var imidlertid kun muligt at påvise RNA-modifikationer i bulkprøver indeholdende >103 celler på grund af metodens begrænsede følsomhed. Disse større prøver skjulte sandsynligvis unikke og funktionelt vigtige RNA-modifikationsprofiler af individuelle celler med populationsgennemsnit. Selv om omhyggelig kontrol af prøveforberedelsesbetingelserne har forbedret detektionsgrænserne for RNA-modifikationer i små volumenprøver 25,26,27,28, er der fortsat behov for analysemetoder, der kan detektere og kvantificere flere modificerede ribonukleosider i enkeltceller.
Denne protokol introducerer enkelt-neuron RNA-modifikationsanalyse ved massespektrometri (SNRMA-MS), som tillader påvisning af over et dusin RNA-modifikationer i enkelte neuroner fra CNS af A. californica29. Fremgangsmåden består af kirurgisk isolering af enkelte, identificerede celler fra større CNS-ganglier efterfulgt af en optimeret prøveforberedelsesarbejdsgang, der involverer mekanisk cellelyse, RNA-denaturering og enzymatisk hydrolyse i en MS-kompatibel buffer. Identifikation og kvantificering af post-transkriptionelt modificerede nukleosider opnås derefter ved hjælp af LC-MS / MS. SNRMA-MS opfylder et uopfyldt behov inden for RNA-modifikationsanalyse ved at lette erhvervelsen af post-transkriptionelle RNA-modifikationsprofiler for enkelte neuroner og har potentiale til fremtidig anvendelse på andre celletyper.
SNRMA-MS udnytter en optimeret prøveforberedelsesmetode, hvilket resulterer i en lille, MS-kompatibel prøvevolumen, der kan leveres til LC-MS-platformen. Den indledende enzymatiske forbehandling af CNS-ganglier dikterer både den lethed, hvormed de kan desheathes og holdbarheden af enkelte neuroner under isolering. Den cerebrale ganglion kræver ofte udvidet enzymatisk behandling på grund af sin relativt tykke kappe sammenlignet med bukkale, pleurale og abdominale ganglier. Individuelle forskere, der udfører de enkelte neuronisoleringer, kan have forskellige præferencer for, hvor holdbar skeden skal være, når man bruger mikrosakser og fine tang. Det er dog vigtigt, at ganglierne ikke overfordøjes, da dette kan føre til tab af deres strukturelle integritet, tab af positionel information, der er afgørende for at identificere målceller og / eller cellelyse. Efter isolering fra ganglion er det vigtigt at sikre, at et minimalt volumen isolationsmedium aspireres, når neuronen overføres til prøverøret. ASW-mediet indeholder en høj koncentration af salte, der kan forstyrre fordøjelsesenzymer under RNA-hydrolyse og vil også fortynde prøven.
Under det mekaniske lysistrin er det almindeligt, at store neuroner (>250 μm diameter) brister ved gentagne gange at passere gennem en mikropipette. Mindre neuroner kan kræve yderligere opmærksomhed for at sikre cellelyse, hvilket typisk indebærer at trykke et glaskapillær på cellen. I dette tilfælde er det muligt, at et delvist volumen af prøvebufferen trækkes ind i kapillæren på grund af kapillærkræfter. Dette volumen kan leveres tilbage i prøverøret ved at anvende tryk på enden af glaskapillæren for at sikre, at ingen prøve går tabt.
De bedste resultater opnås ved at inkludere et opvarmningstrin inden tilsætning af enzymer til RNA-fordøjelse. Dette skyldes sandsynligvis, at opvarmning ved 95 ° C denaturerer RNA-sekundære strukturer, der kan hæmme aktiviteten af RNases35 og mindske mængden af nukleosider frigivet fra RNA-biopolymerer. Kontroleksperimenter ved hjælp af prøver spidset med stabil isotopmærket methionin blev tidligere udført for at undersøge, om varmeinducerede RNA-modifikationsartefakter var årsagen til de øgede topområder, der blev observeret for RNA-modifikationer i forhold til en SNRMA-MS-protokoluden varme 29. Ingen sådan mærkning blev observeret, hvilket indikerer, at de forbedrede signaler for RNA-modifikationer ved anvendelse af den optimerede SNRMA-MS-metode skyldtes overlegen fordøjelse af RNA.
Konventionelle metoder til isolering af total RNA fra celler involverer væske-væskeekstraktion (LLE) med phenol-chloroform og efterfølgende RNA-udfældning, vask og resuspension. Disse tilgange har vist sig nyttige til reverse transkriptionspolymerasekædereaktionseksperimenter, hvor ekspressionen af udvalgte gener let kan overvåges i identificerede A. californica neuroner36,37. LLE-metoder kan imidlertid ikke genvinde tilstrækkeligt RNA til påvisning af modificerede ribonukleosider ved LC-MS, mens SNRMA-MS-metoden beskrevet heri muliggør påvisning af adskillige RNA-modifikationer29. For at vurdere modifikationsprofiler af specifikke RNA-typer (f.eks. rRNA, tRNA, mRNA) i bulkvæv / celleprøver er anionbytning fastfaseekstraktion24, hybridiseringssondebaseret berigelse38 og kromatografisk fraktionering39-tilgange blevet anvendt, men lignende metoder er endnu ikke tilgængelige til enkeltcelle RNA-oprensning. Udviklingen af RNA-fraktioneringsmetoder, der er i stand til at isolere specifikke RNA-typer fra enkeltceller, ville give yderligere indsigt i funktionen af RNA-modifikationer.
SNRMA-MS afslørede tidligere ukarakteriseret heterogenitet i RNA-modifikationslandskabet af enkeltneuroner i A. californica , og det er tænkeligt, at der findes lignende forskellige PTM-profiler på tværs af pattedyrceller. Fordi pattedyrceller er relativt små sammenlignet med de store A. californica neuroner analyseret i denne protokol, er der behov for forbedringer i håndteringen af små prøvevolumener for at lette lavere detektionsgrænser. Selvom SNRMA-MS i øjeblikket er begrænset til mængder på ~ 5 μL, forventes det, at der kan opnås betydelige forbedringer ved at inkorporere mikrofluidiske væskehåndteringsanordninger i arbejdsgangen. Desuden vil implementeringen af automatiserede eller halvautomatiske celleisolationer øge prøvegennemstrømningen og muliggøre enkeltcelle-RNA-modifikationsanalyse af større cellepopulationer. Ved grænseflade med nanoflow LC-separationer27 vil karakteriseringen af epitranscriptomiske mærker i endnu mindre celler være opnåelig.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af National Institute on Drug Abuse under award nr. P30DA018310 og National Human Genome Research Institute under award nr. Rm1HG010023. K.D.C. anerkender støtte fra et Beckman Institute Postdoctoral Fellowship. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis finansieringsorganernes officielle synspunkter.
Animals | |||
Aplysia californica | National Resource for Aplysia (Miami, FL) | 150–250 g (adult) | |
Benchtop equipment | |||
Glass capillary puller | Sutter | P-97 | Equipped with online degasser, autosampler, and thermostatted column compartment |
Milli-Q water purification system | Millipore | Equipped with ESI source | |
Minicentrifuge for PCR tubes | LW Scientific | ZS-1 | |
Optical Microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
Thermocycler | Techne | EW-93945-01 | |
HPLC column and consumables | |||
Acclaim RSLC 120 C18 column | Thermo Scientific | 71399 | |
Autosampler vials | Thermo Scientific | C4011-13 | |
LC and MS Instrumentation and Software | |||
DataAnalysis 4.4 software | Bruker | ||
Dionex Ultimate 3000 nanoLC | Thermo Scientific | ||
Impact HD UHR QqTOF mass spectrometer | Bruker | ||
RStudio | RStudio | ||
Microdissection tools | |||
Microscissors extra fine vannas 3.5” | Roboz | RS-5640 | |
Tungsten needles | Roboz | RS-6065 | |
Reagents/Materials | |||
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane-sulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | H3375 | |
Alkaline phosphatase | Worthington Biochemical Corp. | LS004081 | |
Ammonium acetate | Honeywell | 17836 | |
benzonase (endonuclease from S. marcescens) | EMD Millipore | 70746-4 | |
bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
gentamycin sulfate | Fisher Scientific | G1264 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 208094 | |
nucleosides test mix | Sigma-Aldrich | 47310-U | |
penicillin G | Sigma-Aldrich | P7794 | |
pentostatin | Sigma-Aldrich | SML0508 | |
phosphodiesterase I | Worthington Biochemical Corp. | LS003926 | |
protease type XIV from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Standard glass capillaries | A-M Systems | 626000 | 1 mm o.d., 0.5 mm i.d., 4 in |
streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 |