En vævsrensningsmetode til neuronal billeddannelse fra mesoskopisk til mikroskopisk skala
Summary
Protokollen giver en detaljeret metode til neuronal billeddannelse i hjerneskive ved hjælp af en vævsrensningsmetode, ScaleSF. Protokollen omfatter hjernevævsforberedelse, vævsafklaring, håndtering af ryddede skiver og konfokal laserscanning mikroskopi billeddannelse af neuronale strukturer fra mesoskopiske til mikroskopiske niveauer.
Abstract
En detaljeret protokol er tilvejebragt her for at visualisere neuronale strukturer fra mesoskopiske til mikroskopiske niveauer i hjernevæv. Neuronale strukturer, der spænder fra neurale kredsløb til subcellulære neuronale strukturer, visualiseres i musehjerneskiver optisk ryddet med ScaleSF. Denne clearingmetode er en modificeret version af ScaleS og er en hydrofil vævsrensningsmetode til vævsskiver, der opnår potent rydningsevne samt et højt niveau af bevarelse af fluorescenssignaler og strukturel integritet. Et tilpasseligt tredimensionelt (3D) -printet billedbehandlingskammer er designet til pålidelig montering af ryddet hjernevæv. Musehjerner injiceret med en adeno-associeret virusvektor, der bærer forbedret grønt fluorescerende proteingen, blev fikseret med 4% paraformaldehyd og skåret i skiver med 1 mm tykkelse med en vibrerende vævsskiver. Hjerneskiverne blev ryddet ved at følge clearingprotokollen, som inkluderer sekventielle inkubationer i tre opløsninger, nemlig ScaleS0-opløsning, phosphatbuffer saltvand (–) og ScaleS4-opløsning i alt 10,5-14,5 timer. De rensede hjerneskiver blev monteret på billeddannelseskammeret og indlejret i 1,5% agarosegel opløst i ScaleS4D25(0)-opløsning. 3D-billedoptagelsen af skiverne blev udført ved hjælp af et konfokalt laserscanningsmikroskop udstyret med en multi-immersion objektiv linse med lang arbejdsafstand. Begyndende med mesoskopisk neuronal billeddannelse lykkedes det os at visualisere fine subcellulære neuronale strukturer, såsom dendritiske rygsøjler og axonale boutoner, i de optisk ryddede hjerneskiver. Denne protokol ville lette forståelsen af neuronale strukturer fra kredsløb til subcellulære komponentskalaer.
Introduction
Vævsrydningsmetoder har forbedret dybdeuafhængig billeddannelse af biologiske og kliniske prøver med lysmikroskopi, hvilket giver mulighed for ekstraktion af strukturelle oplysninger om intakt væv 1,2. Optiske clearingteknikker kan også potentielt fremskynde og reducere omkostningerne til histologisk analyse. I øjeblikket er der tre store clearingmetoder til rådighed: hydrofile, hydrofobe og hydrogelbaserede metoder 1,2. Hydrofile tilgange overgår i at bevare fluorescenssignaler og vævsintegritet og er mindre giftige sammenlignet med de to andre tilgange 3,4.
En hydrofil clearingmetode, ScaleS, har en karakteristisk position med sin bevarelse af strukturel og molekylær integritet samt potent clearingkapacitet (clearing-preservation spectrum)5. I en tidligere undersøgelse udviklede vi en hurtig og isometrisk clearingprotokol, ScaleSF, for vævsskiver (~ 1 mm tykkelse) ved at ændre clearingproceduren for ScaleS6. Denne clearingprotokol kræver sekventielle inkubationer af hjerneskiver i tre opløsninger i 10,5-14,5 timer. Metoden er udstyret med et højt clearingbevarende spektrum, som er kompatibelt selv med elektronmikroskopi (EM) analyse (supplerende figur 1), hvilket giver mulighed for multi-skala høj opløsning tredimensionel (3D) billeddannelse med nøjagtig signalrekonstruktion6. Således bør ScaleSF være effektiv især i hjernen, hvor neuronale celler udarbejder sprudlende processer af enorm længde og arrangerer specialiserede fine subcellulære strukturer til transmission og modtagelse af information. Ekstraktion af strukturel information med skalaer fra kredsløb til subcellulære niveauer på neuronale celler er ret nyttig til bedre forståelse af hjernefunktioner.
Her giver vi en detaljeret protokol til at visualisere neuronale strukturer med skalaer fra det meskopiske / kredsløb til mikroskopisk / subcellulært niveau ved hjælp af ScaleSF. Protokollen omfatter vævsforberedelse, vævsafklaring, håndtering af ryddet væv og konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) billeddannelse af ryddet væv. Vores protokol fokuserer på at forhøre neuronale strukturer fra kredsløb til subcellulære komponentskalaer. For en detaljeret procedure til fremstilling af opløsninger og stereotaxisk injektion af adeno-associerede virus (AAV) vektorer i musehjerner henvises til henholdsvis Miyawaki et al. 20167 og Okamoto et al. 20218.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trin i protokollen
Der er et par kritiske trin i protokollen, der skal udføres med største forsigtighed for at opnå meningsfulde resultater. Ensartet fiksering af prøver er afgørende for 3D-billeddannelse i store væv. Objektivlinsen, prøven og nedsænkningsvæsken skal have matchende RI. RI-mismatch blandt dem vil føre til stærkt forstyrret billeddannelse af EGFP-ekspressive celler i de ryddede hjerneskiver (figur 3). Justeringen af objektivlinsen til nedsænkningsv?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Yoko Ishida (Juntendo University) for AAV vektorproduktion og Kisara Hoshino (Juntendo University) for teknisk bistand. Denne undersøgelse blev støttet af JSPS KAKENHI (JP20K07231 til K.Y.; JP21H03529 til T.F.; JP20K07743 til M.K.; JP21H02592 til H.H.) og videnskabelig forskning om innovativt område “Resonans Bio” (JP18H04743 til H.H.). Denne undersøgelse blev også støttet af Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (JP21dm0207112 til T.F. og H.H.), Moonshot R&D fra Japan Science and Technology Agency (JST) (JPMJMS2024 til H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) fra JST (JPMJFR204D til H.H.), Grants-in-Aid fra Research Institute for Diseases of Old Age ved Juntendo University School of Medicine (X2016 til K.Y.; X2001 til H.H.) og Privatskolens brandingprojekt.
Materials
| 16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
References
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Furuta, T., et al. Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF. iScience. 25 (1), 103601 (2022).
- Miyawaki, A., et al. Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy. Protocol Exchange. , (2016).
- Okamoto, S., et al. Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system. STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).
- Kameda, H., et al. Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites. The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).
- Sohn, J., et al. A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system. PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).
- Kuramoto, E., et al. Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors. Cerebral Cortex. 19 (9), 2065-2077 (2009).
- Matsuda, W., et al. Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
- Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
- Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6, 34331 (2016).
