Summary

Метод очистки тканей для визуализации нейронов от мезоскопических до микроскопических масштабов

Published: May 10, 2022
doi:

Summary

Протокол предоставляет подробный метод визуализации нейронов в срезе мозга с использованием метода очистки тканей ScaleSF. Протокол включает в себя подготовку тканей головного мозга, осветление тканей, обработку очищенных срезов и конфокальную лазерную сканирующую микроскопическую визуализацию нейронных структур от мезоскопического до микроскопического уровней.

Abstract

Здесь представлен подробный протокол для визуализации нейронных структур от мезоскопического до микроскопического уровней в тканях мозга. Нейронные структуры, начиная от нейронных цепей и заканчивая субклеточными нейронными структурами, визуализируются в срезах мозга мыши, оптически очищенных с помощью ScaleSF. Этот метод очистки является модифицированной версией ScaleS и представляет собой гидрофильный метод очистки тканей для срезов тканей, который обеспечивает мощную очищающую способность, а также высокий уровень сохранения флуоресцентных сигналов и структурной целостности. Настраиваемая трехмерная (3D)-печатная камера визуализации предназначена для надежного монтажа очищенных тканей мозга. Мозг мыши, которому вводили аденоассоциированный вирусный вектор, несущий усиленный ген зеленого флуоресцентного белка, фиксировали 4% параформальдегидом и разрезали на срезы толщиной 1 мм с помощью вибрирующего слайсера тканей. Срезы мозга очищали в соответствии с протоколом очистки, который включал последовательные инкубации в трех растворах, а именно: раствор scaleS0, фосфатный буферный физиологический раствор (-) и раствор ScaleS4, в общей сложности 10,5-14,5 ч. Очищенные срезы мозга были установлены на камере визуализации и встроены в 1,5% агарозный гель, растворенный в растворе ScaleS4D25(0). Получение 3D-изображения срезов осуществлялось с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, оснащенного мульти-погружным объективом большого рабочего расстояния. Начиная с мезоскопической нейрональной визуализации, нам удалось визуализировать тонкие субклеточные нейронные структуры, такие как дендритные шипы и аксональные бутоны, в оптически очищенных срезах мозга. Этот протокол облегчит понимание нейронных структур от схемы до субклеточных компонентных масштабов.

Introduction

Методы очистки тканей улучшили глубинно-независимую визуализацию биологических и клинических образцов с помощью световой микроскопии, что позволяет извлекать структурную информацию на интактных тканях 1,2. Методы оптической очистки также могут потенциально ускорить и снизить стоимость гистологического анализа. В настоящее время существуют три основных подхода к очистке: гидрофильный, гидрофобный и гидрогелевой методы 1,2. Гидрофильные подходы превосходят в сохранении флуоресцентных сигналов и целостности тканей и менее токсичны по сравнению с двумя другими подходами 3,4.

Гидрофильный метод очистки, ScaleS, занимает отличительное положение с сохранением структурной и молекулярной целостности, а также мощной очищающей способностью (спектр очистки-сохранения)5. В предыдущем исследовании мы разработали протокол быстрой и изометрической очистки, ScaleSF, для срезов тканей (толщина ~ 1 мм), изменив процедуру очистки ScaleS6. Этот протокол очистки требует последовательных инкубаций срезов мозга в трех растворах в течение 10,5-14,5 ч. Метод отличается высоким спектром очистки-сохранения, который совместим даже с электронным микроскопическим (ЭМ) анализом (дополнительный рисунок 1), что позволяет создавать многомасштабную трехмерную (3D) визуализацию высокого разрешения с точной реконструкцией сигнала6. Таким образом, ScaleSF должен быть эффективен, особенно в головном мозге, где нейронные клетки развивают буйные процессы огромной длины и организуют специализированные тонкие субклеточные структуры для передачи и приема информации. Извлечение структурной информации с помощью шкал от контурного до субклеточного уровней на нейронных клетках весьма полезно для лучшего понимания функций мозга.

Здесь мы предоставляем подробный протокол для визуализации нейронных структур с масштабами от мезоскопического / схемы до микроскопического / субклеточного уровня с использованием ScaleSF. Протокол включает в себя подготовку тканей, осветление тканей, обработку очищенных тканей и конфокальную лазерную сканирующую микроскопию (CLSM) визуализацию очищенных тканей. Наш протокол фокусируется на опросе нейронных структур от схемы до субклеточных компонентных масштабов. Подробную процедуру приготовления растворов и стереотаксической инъекции векторов аденоассоциированного вируса (AAV) в мозг мыши см. в Miyawaki et al. 20167 и Okamoto et al. 20218, соответственно.

Protocol

Все эксперименты были одобрены институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию Университета Дзюнтендо (одобрение No 2021245, 2021246) и выполнены в соответствии с Фундаментальными руководящими принципами надлежащего проведения экспериментов на животных Научным совет…

Representative Results

Оптическая очистка среза мозга мыши толщиной 1 мм была достигнута с использованием этого протокола. Рисунок 1B представляет собой изображения передачи среза мозга мыши до и после очистки. Метод очистки тканей сделал срез мозга мыши толщиной 1 мм прозрачным. Незначительное расш?…

Discussion

Критические шаги в рамках протокола
В протоколе есть несколько критических шагов, которые следует выполнять с максимальной осторожностью для получения значимых результатов. Равномерная фиксация образцов необходима для 3D-визуализации в крупномасштабных тканях. Объектив, о…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят Йоко Исиду (Университет Дзюнтендо) за производство векторов AAV и Кисару Хосино (Университет Дзюнтендо) за техническую помощь. Это исследование было поддержано JSPS KAKENHI (JP20K07231 to K.Y.; JP21H03529 в Т.Ф.; JP20K07743 в М.К.; JP21H02592 в H.H.) и научные исследования по инновационной области «Резонанс био» (JP18H04743 to H.H.). Это исследование также было поддержано Японским агентством медицинских исследований и разработок (AMED) (JP21dm0207112 to T.F. и H.H.), Moonshot R&D от Японского агентства по науке и технике (JST) (JPMJMS2024 до H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) от JST (JPMJFR204D to H.H.), Грантами в помощь от Научно-исследовательского института заболеваний пожилого возраста в Медицинской школе Университета Джунтендо (X2016 до K.Y.; X2001 – H.H.), и проект брендинга частных школ.

Materials

16x multi-immersion objective lens Leica Microsystems HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR
Agar Nacalai Tesque 01028-85
Agarose TaKaRa Bio L03
Dimethyl sulfoxide Nacalai Tesque 13407-45
D-Sorbitol Nacalai Tesque 06286-55
γ-cyclodextrin Wako Pure Chemical Industries 037-10643
Glycerol Sigma-Aldrich G9012
Huygens Essential Scientific Volume Imaging ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b
Imaris Bitplane ver. 9.0.0
Leica Application Suite X Leica Microsystems LAS X, ver. 3.5.5.19976
Methyl-β-cyclodextrin Tokyo Chemical Industry M1356
Paraformaldehyde Merck Millipore 1.04005.1000
Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) Nacalai Tesque 27575-31 10x PBS(–)
Sodium azide Nacalai Tesque 31233-55
Sodium pentobarbital Kyoritsu Seiyaku N/A
TCS SP8 Leica Microsystems N/A
Triton X-100 Nacalai Tesque 35501-15
Urea Nacalai Tesque 35940-65
Vibrating tissue slicer Dosaka EM PRO7N

References

  1. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  2. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
  3. Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
  4. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
  5. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  6. Furuta, T., et al. Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF. iScience. 25 (1), 103601 (2022).
  7. Miyawaki, A., et al. Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy. Protocol Exchange. , (2016).
  8. Okamoto, S., et al. Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system. STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).
  9. Kameda, H., et al. Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites. The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).
  10. Sohn, J., et al. A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system. PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).
  11. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  12. Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).
  13. Kuramoto, E., et al. Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors. Cerebral Cortex. 19 (9), 2065-2077 (2009).
  14. Matsuda, W., et al. Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
  15. Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
  16. Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
  17. Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6, 34331 (2016).

Play Video

Cite This Article
Yamauchi, K., Okamoto, S., Takahashi, M., Koike, M., Furuta, T., Hioki, H. A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales. J. Vis. Exp. (183), e63941, doi:10.3791/63941 (2022).

View Video