Een weefselzuiveringsmethode voor neuronale beeldvorming van mesoscopische tot microscopische schalen

Kenta Yamauchi; Shinichiro Okamoto; Megumu Takahashi; Masato Koike; Takahiro Furuta; Hiroyuki Hioki

doi:10.3791/63941

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een weefselzuiveringsmethode voor neuronale beeldvorming van mesoscopische tot microscopische schalen

3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63941

⸱

10 mei 2022

Kenta Yamauchi¹^,² , Shinichiro Okamoto¹^,²^,³ , Megumu Takahashi¹^,²^,⁴^,⁵ , Masato Koike²^,³ , Takahiro Furuta⁶ , Hiroyuki Hioki¹^,²^,⁷

¹Department of Neuroanatomy, Juntendo University Graduate School of Medicine, ²Department of Cell Biology and Neuroscience, Juntendo University Graduate School of Medicine, ³Advanced Research Institute for Health Sciences, Juntendo University, ⁴Department of Neuroscience, Graduate School of Medicine, Kyoto University, ⁵Japan Society for the Promotion of Science, ⁶Department of Oral Anatomy and Neurobiology, Graduate School of Dentistry, Osaka University, ⁷Department of Multi-Scale Brain Structure Imaging, Juntendo University Graduate School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Het protocol biedt een gedetailleerde methode van neuronale beeldvorming in hersensegmenten met behulp van een weefselzuiveringsmethode, ScaleSF. Het protocol omvat hersenweefselvoorbereiding, weefselverheldering, behandeling van gewiste plakjes en confocale laserscanmicroscopie beeldvorming van neuronale structuren van mesoscopische tot microscopische niveaus.

Samenvatting

Een gedetailleerd protocol wordt hier verstrekt om neuronale structuren van mesoscopische tot microscopische niveaus in hersenweefsels te visualiseren. Neuronale structuren, variërend van neurale circuits tot subcellulaire neuronale structuren, worden gevisualiseerd in hersensneden van muizen die optisch zijn gewist met ScaleSF. Deze clearingmethode is een aangepaste versie van ScaleS en is een hydrofiele weefselzuiveringsmethode voor weefselplakken die krachtige clearingcapaciteit bereikt, evenals een hoog niveau van behoud van fluorescentiesignalen en structurele integriteit. Een aanpasbare driedimensionale (3D) geprinte beeldkamer is ontworpen voor betrouwbare montage van vrijgemaakte hersenweefsels. Muizenhersenen geïnjecteerd met een adeno-geassocieerde virusvector met verbeterd groen fluorescerend eiwitgen werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde en in plakjes van 1 mm dikte gesneden met een trillende weefselsnijder. De hersenschijfjes werden gewist door het clearingprotocol te volgen, dat sequentiële incubaties in drie oplossingen omvat, namelijk ScaleS0-oplossing, fosfaatbufferzoutoplossing (–) en ScaleS4-oplossing, voor een totaal van 10,5-14,5 uur. De gewiste hersenplakken werden op de beeldkamer gemonteerd en ingebed in 1,5% agarose-gel opgelost in ScaleS4D25(0)-oplossing. De 3D-beeldacquisitie van de plakjes werd uitgevoerd met behulp van een confocale laserscanmicroscoop uitgerust met een multi-immersie objectieflens van een lange werkafstand. Beginnend met mesoscopische neuronale beeldvorming, slaagden we erin om fijne subcellulaire neuronale structuren, zoals dendritische stekels en axonale boutons, in de optisch geklaarde hersenplakken te visualiseren. Dit protocol zou het begrip van neuronale structuren van circuit- tot subcellulaire componentschalen vergemakkelijken.

Inleiding

Weefselopruimingsmethoden hebben de diepte-onafhankelijke beeldvorming van biologische en klinische monsters met lichtmicroscopie verbeterd, waardoor structurele informatie over intacte weefsels kan worden geëxtraheerd ^1,2. Optische clearingtechnieken kunnen mogelijk ook versnellen en de kosten voor histologische analyse verlagen. Momenteel zijn er drie belangrijke clearingbenaderingen beschikbaar: hydrofiele, hydrofobe en hydrogel-gebaseerde methoden ^1,2. Hydrofiele benaderingen overtreffen in het behoud van fluorescentiesignalen en weefselintegriteit....