प्रोटोकॉल एक ऊतक समाशोधन विधि, एससीएएलईएसएफ का उपयोग करके मस्तिष्क के टुकड़े में न्यूरोनल इमेजिंग की एक विस्तृत विधि प्रदान करता है। प्रोटोकॉल में मस्तिष्क ऊतक तैयारी, ऊतक स्पष्टीकरण, साफ स्लाइस की हैंडलिंग और मेसोस्कोपिक से सूक्ष्म स्तर तक न्यूरोनल संरचनाओं की कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी इमेजिंग शामिल है।
मस्तिष्क के ऊतकों में मेसोस्कोपिक से सूक्ष्म स्तर तक न्यूरोनल संरचनाओं की कल्पना करने के लिए यहां एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। तंत्रिका सर्किट से लेकर उपकोशिकीय न्यूरोनल संरचनाओं तक न्यूरोनल संरचनाओं को एससीएएलईएसएफ के साथ ऑप्टिकल रूप से साफ किए गए माउस मस्तिष्क स्लाइस में देखा जाता है। यह समाशोधन विधि एससीएएलईएस का एक संशोधित संस्करण है और ऊतक स्लाइस के लिए एक हाइड्रोफिलिक ऊतक समाशोधन विधि है जो शक्तिशाली समाशोधन क्षमता के साथ-साथ प्रतिदीप्ति संकेतों और संरचनात्मक अखंडता के संरक्षण के उच्च स्तर को प्राप्त करती है। एक अनुकूलन तीन आयामी (3 डी) मुद्रित इमेजिंग कक्ष को साफ़ मस्तिष्क के ऊतकों के विश्वसनीय बढ़ते के लिए डिज़ाइन किया गया है। बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन ले जाने वाले एडेनो से जुड़े वायरस वेक्टर के साथ इंजेक्शन माउस दिमाग को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया था और एक कंपन ऊतक स्लाइसर के साथ 1 मिमी मोटाई के स्लाइस में काट दिया गया था। मस्तिष्क स्लाइस समाशोधन प्रोटोकॉल का पालन करके साफ कर दिया गया था, जिसमें तीन समाधानों में अनुक्रमिक ऊष्मायन शामिल हैं, अर्थात्, एससीएएलईएस 0 समाधान, फॉस्फेट बफर खारा (-), और एससीएएलईएस 4 समाधान, कुल 10.5-14.5 घंटे के लिए। साफ़ किए गए मस्तिष्क स्लाइस इमेजिंग कक्ष पर लगाए गए थे और एससीएएलईएस 4 डी 25 (0) समाधान में भंग 1.5% एगारोज़ जेल में एम्बेडेड थे। स्लाइस का 3 डी छवि अधिग्रहण एक लंबी कामकाजी दूरी के बहु-विसर्जन उद्देश्य लेंस से लैस एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया गया था। मेसोस्कोपिक न्यूरोनल इमेजिंग के साथ शुरुआत करते हुए, हम ऑप्टिकल रूप से साफ मस्तिष्क स्लाइस में डेंड्राइटिक स्पाइन और एक्सोनल बाउटन जैसे ठीक उपकोशिकीय न्यूरोनल संरचनाओं की कल्पना करने में सफल रहे। यह प्रोटोकॉल सर्किट से उपकोशिकीय घटक तराजू तक न्यूरोनल संरचनाओं को समझने की सुविधा प्रदान करेगा।
ऊतक समाशोधन विधियों ने प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ जैविक और नैदानिक नमूनों की गहराई-स्वतंत्र इमेजिंग में सुधार किया है, जिससे बरकरारऊतकों 1,2 पर संरचनात्मक जानकारी के निष्कर्षण की अनुमति मिलती है। ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक भी संभावित रूप से गति दे सकती है, और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण की लागत को कम कर सकती है। वर्तमान में, तीन प्रमुख समाशोधन दृष्टिकोण उपलब्ध हैं: हाइड्रोफिलिक, हाइड्रोफोबिक और हाइड्रोगेल-आधारित तरीके 1,2। हाइड्रोफिलिक दृष्टिकोण प्रतिदीप्ति संकेतों और ऊतक अखंडता को संरक्षित करने में पार करते हैं और अन्य दोदृष्टिकोण3,4 की तुलना में कम विषाक्त होते हैं।
एक हाइड्रोफिलिक समाशोधन विधि, एससीएएलईएस, संरचनात्मक और आणविक अखंडता के संरक्षण के साथ-साथ शक्तिशाली समाशोधन क्षमता (समाशोधन-संरक्षण स्पेक्ट्रम) के साथ एक विशिष्ट स्थिति रखती है। पिछले अध्ययन में, हमने एससीएएलईएस6 की समाशोधन प्रक्रिया को संशोधित करके ऊतक स्लाइस (~ 1-मिमी मोटाई) के लिए एक तेजी से और आइसोमेट्रिक समाशोधन प्रोटोकॉल, एससीएएलईएसएफ विकसित किया। इस समाशोधन प्रोटोकॉल 10.5-14.5 घंटे के लिए तीन समाधान में मस्तिष्क स्लाइस के अनुक्रमिक ऊष्मायन की आवश्यकता है। विधि को एक उच्च समाशोधन-संरक्षण स्पेक्ट्रम के साथ चित्रित किया गया है, जो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) विश्लेषण (पूरक चित्रा 1) के साथ भी संगत है, जो सटीक सिग्नल पुनर्निर्माण 6 के साथ बहु-पैमाने पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन तीन आयामी (3 डी) इमेजिंग की अनुमति देताहै। इस प्रकार, एससीएएलईएसएफ विशेष रूप से मस्तिष्क में प्रभावी होना चाहिए, जहां न्यूरोनल कोशिकाएं जबरदस्त लंबाई की विपुल प्रक्रियाओं को विस्तृत करती हैं, और जानकारी प्रसारित करने और प्राप्त करने के लिए विशेष ठीक उपकोशिकीय संरचनाओं की व्यवस्था करती हैं। न्यूरोनल कोशिकाओं पर सर्किट से उपकोशिकीय स्तरों तक तराजू के साथ संरचनात्मक जानकारी निकालना मस्तिष्क कार्यों की बेहतर समझ की दिशा में काफी उपयोगी है।
यहां, हम एससीएएलईएसएफ का उपयोग करके मेसोस्कोपिक /सर्किट से सूक्ष्म /उपकोशिकीय स्तर तक तराजू के साथ न्यूरोनल संरचनाओं की कल्पना करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल में ऊतक तैयारी, ऊतक स्पष्टीकरण, साफ ऊतकों की हैंडलिंग, और साफ ऊतकों की कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) इमेजिंग शामिल है। हमारा प्रोटोकॉल सर्किट से उपकोशिकीय घटक तराजू तक न्यूरोनल संरचनाओं से पूछताछ करने पर केंद्रित है। माउस दिमाग में एडेनो-जुड़े वायरस (एएवी) वैक्टर के समाधान और स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन की तैयारी के लिए एक विस्तृतप्रक्रिया के लिए, क्रमशः मियावाकी एट अल।
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए अत्यंत सावधानी के साथ आयोजित किया जाना चाहिए। बड़े पैमाने पर ऊतकों के भीतर 3 डी …
The authors have nothing to disclose.
लेखक एएवी वेक्टर उत्पादन के लिए योको इशिदा (जुंटेंडो विश्वविद्यालय) और तकनीकी सहायता के लिए किसारा होशिनो (जुंटेंडो विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को जेएसपीएस काकेन्ही (जेपी 20 के 07231 से केवाई) द्वारा समर्थित किया गया था; जेपी 21 एच 03529 से टी.एफ.; जेपी 20के07743 से एम.के.; जेपी 21 एच 02592 से एचएच) और अभिनव क्षेत्र “अनुनाद जैव” (जेपी 18 एच 04743 से एचएच) पर वैज्ञानिक अनुसंधान। इस अध्ययन को जापान एजेंसी फॉर मेडिकल रिसर्च एंड डेवलपमेंट (एएमईडी) (जेपी 21 डीएम0207112 से टीएफ और एचएच), जापान साइंस एंड टेक्नोलॉजी एजेंसी (जेएसटी) (जेपीएमजेएमएस 2024 से एचएच) से मूनशॉट आर एंड डी, जेएसटी से विघटनकारी विज्ञान और प्रौद्योगिकी (वन) के लिए फ्यूजन ओरिएंटेड रिसर्च (जेपीएमजेएफआर 204 डी से एचएच), अनुसंधान संस्थान से अनुदान सहायता द्वारा भी समर्थित किया गया था। एचएच के लिए एक्स 2001), और निजी स्कूल ब्रांडिंग परियोजना।
16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |