En vevsryddingsmetode for nevronal avbildning fra mesoskopisk til mikroskopisk skala
Summary
Protokollen gir en detaljert metode for nevronal avbildning i hjerneskive ved hjelp av en vevsryddingsmetode, ScaleSF. Protokollen inkluderer hjernevevsforberedelse, vevsavklaring, håndtering av ryddede skiver og konfikal laserskanning av mikroskopisk avbildning av nevronstrukturer fra mesoskopisk til mikroskopisk nivå.
Abstract
En detaljert protokoll er gitt her for å visualisere nevronstrukturer fra mesoskopisk til mikroskopisk nivå i hjernevev. Nevronale strukturer som spenner fra nevrale kretser til subcellulære nevronstrukturer visualiseres i musehjerneskiver optisk ryddet med ScaleSF. Denne avregningsmetoden er en modifisert versjon av ScaleS og er en hydrofil vevsryddingsmetode for vevsskiver som oppnår potent clearing evne samt et høyt nivå av bevaring av fluorescenssignaler og strukturell integritet. Et tredimensjonalt (3D)-trykt bildekammer som kan tilpasses, er utformet for pålitelig montering av renset hjernevev. Musehjerner injisert med en adeno-assosiert virusvektor med forbedret grønt fluorescerende proteingen ble festet med 4% paraformaldehyd og kuttet i skiver med 1 mm tykkelse med en vibrerende vevsskive. Hjerneskivene ble ryddet ved å følge clearingprotokollen, som inkluderer sekvensielle inkubasjoner i tre løsninger, nemlig ScaleS0-løsning, fosfatbuffers saltløsning (–) og ScaleS4-løsning, i totalt 10,5–14,5 timer. De ryddede hjerneskivene ble montert på bildekammeret og innebygd i 1,5% agarose gel oppløst i ScaleS4D25 (0) løsning. 3D-bildeanskaffelsen av skivene ble utført ved hjelp av et konfokalt laserskanningsmikroskop utstyrt med en multi-nedsenking objektiv linse med lang arbeidsavstand. Fra og med mesoskopisk nevronal avbildning lyktes vi i å visualisere fine subcellulære nevronstrukturer, som dendritiske spines og axonale boutons, i de optisk ryddede hjerneskivene. Denne protokollen vil lette forståelsen av nevronstrukturer fra krets til subcellulære komponentskalaer.
Introduction
Vevsryddingsmetoder har forbedret dybdeuavhengig avbildning av biologiske og kliniske prøver med lett mikroskopi, noe som muliggjør utvinning av strukturell informasjon om intakt vev 1,2. Optiske clearingteknikker kan også potensielt øke hastigheten, og redusere kostnadene for histologisk analyse. For tiden er tre store clearing tilnærminger tilgjengelige: hydrofile, hydrofobe og hydrogelbaserte metoder 1,2. Hydrofile tilnærminger overgår i å bevare fluorescenssignaler og vevsintegritet og er mindre giftige sammenlignet med de to andre tilnærmingene 3,4.
En hydrofil clearingmetode, ScaleS, har en særegen posisjon med bevaring av strukturell og molekylær integritet samt potent clearing evne (clearing-bevaring spektrum)5. I en tidligere studie utviklet vi en rask og isometrisk clearingprotokoll, ScaleSF, for vevsskiver (~ 1 mm tykkelse) ved å endre clearingprosedyren til ScaleS6. Denne clearingprotokollen krever sekvensielle inkubasjoner av hjerneskiver i tre løsninger i 10,5-14,5 timer. Metoden er omtalt med et høyt clearing-konserveringsspekter, som er kompatibelt selv med elektronmikroskopianalyse (EM) (Supplementary Figure 1), noe som muliggjør tredimensjonal (3D) bildebehandling med høy oppløsning med nøyaktig signalrekonstruksjon6. Dermed bør ScaleSF være effektiv spesielt i hjernen, hvor nevronceller utarbeider sprudlende prosesser av enorm lengde, og ordner spesialiserte fine subcellulære strukturer for overføring og mottak av informasjon. Å trekke ut strukturell informasjon med skalaer fra krets til subcellulære nivåer på nevronceller er ganske nyttig for bedre forståelse av hjernefunksjoner.
Her gir vi en detaljert protokoll for å visualisere nevronstrukturer med skalaer fra mesoskopisk / krets til mikroskopisk / subcellulært nivå ved hjelp av ScaleSF. Protokollen inkluderer vevsforberedelse, vevsavklaring, håndtering av ryddet vev og konfikal laserskanning av mikroskopi (CLSM) avbildning av ryddet vev. Vår protokoll fokuserer på å forhøre nevronstrukturer fra krets til subcellulære komponentskalaer. For en detaljert prosedyre for fremstilling av løsninger og stereotaxisk injeksjon av adeno-assosierte virus (AAV) vektorer i musehjerner, se Miyawaki et al. 20167 og Okamoto et al. 20218, henholdsvis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trinn i protokollen
Det er noen få kritiske trinn i protokollen som bør utføres med største forsiktighet for å oppnå meningsfulle resultater. Ensartet fiksering av prøver er avgjørende for 3D-avbildning i store vev. Objektivlinsen, prøven og nedsenkningsvæsken skal ha matchende RI. RI-mismatch blant dem vil føre til svært forstyrret avbildning av EGFP-uttrykkende celler i de ryddede hjerneskivene (figur 3). Justeringen av korreksjonskragen til objektivet til nedse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Yoko Ishida (Juntendo University) for AAV vektorproduksjon og Kisara Hoshino (Juntendo University) for teknisk assistanse. Denne studien ble støttet av JSPS KAKENHI (JP20K07231 til K.Y.; JP21H03529 til T.F.; JP20K07743 til M.K.; JP21H02592 til H.H.) og vitenskapelig forskning på innovativt område “Resonance Bio” (JP18H04743 til H.H.). Denne studien ble også støttet av Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (JP21dm0207112 til T.F. og H.H.), Moonshot R&D fra Japan Science and Technology Agency (JST) (JPMJMS2024 til H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) fra JST (JPMJFR204D til H.H.), Grants-in-Aid fra Research Institute for Diseases of Old Age ved Juntendo University School of Medicine (X2016 til K.Y.; X2001 til H.H.), og Private School Branding Project.
Materials
| 16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
References
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Furuta, T., et al. Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF. iScience. 25 (1), 103601 (2022).
- Miyawaki, A., et al. Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy. Protocol Exchange. , (2016).
- Okamoto, S., et al. Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system. STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).
- Kameda, H., et al. Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites. The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).
- Sohn, J., et al. A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system. PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).
- Kuramoto, E., et al. Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors. Cerebral Cortex. 19 (9), 2065-2077 (2009).
- Matsuda, W., et al. Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
- Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
- Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6, 34331 (2016).
