Administration par médiation lentivirale d’ARNs aux CSEh et aux PNJ à l’aide de polyéthylénimine polymère cationique à faible coût (PEI)

Summary

En utilisant le polymère cationique à faible coût polyéthylénimine (PEI), nous avons produit des particules lentivirales pour l’expression stable des shRNA dans les cellules souches embryonnaires humaines H9 (CSEh) et les cellules progénitrices neurales (NPC) dérivées de H9 transduites transitoirement à haute efficacité.

Abstract

Le protocole actuel décrit l’utilisation de particules lentivirales pour l’administration d’ARN courts en épingle à cheveux (shRNA) à la fois aux cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ainsi qu’aux cellules progénitrices neurales (NPC) dérivées des CSEh à haute efficacité. Les particules lentivirales ont été générées en co-transfectant des cellules HEK293T à l’aide de vecteurs d’entrée (porteurs d’ARNh) ainsi que de plasmides d’emballage (pAX et pMD2.G) à l’aide du polymère cationique à faible coût polyéthylénimine (PEI). Les particules virales ont été concentrées par ultracentrifugation, ce qui a donné des titres moyens supérieurs à 5 x 10⁷. Les CSEh et les CNP pourraient être infectés à des rendements élevés à l’aide de ces particules lentivirales, comme le montrent la sélection de la puromycine et l’expression stable dans les CSEh, ainsi que l’expression transitoire de GFP dans les CNP. De plus, l’analyse par transfert western a montré une réduction significative de l’expression des gènes ciblés par les shRNA. En outre, les cellules ont conservé leur pluripotence ainsi que leur potentiel de différenciation, comme en témoigne leur différenciation ultérieure en différentes lignées de SNC. Le protocole actuel traite de la livraison des shRNA; cependant, la même approche pourrait être utilisée pour l’expression ectopique des ADNc pour les études de surexpression.

Introduction

Les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) dérivées de la masse cellulaire interne du blastocyste sont pluripotentes et peuvent être différenciées en différents types de cellules en fonction de facteurs externes dans des conditions in vitro ^1,2. Afin d’exploiter pleinement le potentiel des CSEh, il est impératif de disposer de méthodes d’administration rapides et fiables des gènes pour ces cellules. Classiquement, les techniques utilisées peuvent être classées en deux types : les systèmes d’administration de gènes non viraux et viraux ^3,4. Les systèmes d’administration de gènes non viraux les plus fréquemment utilisés sont la lipofection, l’électroporation et la nucléofection. Les systèmes d’administration non virale sont avantageux en raison de moins de mutations d’insertion et d’une diminution globale de l’immunogénicité ^5,6. Cependant, ces méthodes entraînent une faible efficacité de transfection et une courte durée d’expression génique transitoire, ce qui est une limitation majeure pour les études de différenciation à long terme⁷. L’électroporation se traduit par une meilleure efficacité de transfection par rapport à la lipofection; cependant, il en résulte plus de 50% de mort cellulaire ^8,9,10. En utilisant la nucléofection, la survie cellulaire et l’efficacité de la transfection peuvent être améliorées en combinant la lipofection et l’électroporation, mais l’approche nécessite des tampons spécifiques aux cellules et un équipement spécialisé et, par conséquent, devient assez coûteuse pour les applications à grande échelle^11,12.

En revanche, les vecteurs viraux ont montré une amélioration de l’efficacité de la transfection, ainsi qu’une faible cytotoxicité globale, après la transduction. De plus, les gènes délivrés sont exprimés de manière stable et, par conséquent, rendent cette méthode idéale pour les études à long terme¹³. Parmi les vecteurs viraux les plus couramment utilisés pour l’administration de gènes dans les CSEh figurent les vecteurs lentiviraux (LVS), qui peuvent donner une efficacité de transduction de plus de 80% en utilisant des particules virales à titre élevé^14,15. La lipofection et la précipitation de CaPO₄ sont parmi les méthodes les plus couramment utilisées pour transfecter transitoirement les cellules HEK293T ou ses dérivés avec des vecteurs de transfert de gènes ainsi que des plasmides d’emballage pour produire des particules lentivirales¹⁶. Bien que la lipofection entraîne une bonne efficacité de transfection et une faible cytotoxicité, la technique est entravée par son coût, et la mise à l’échelle pour obtenir des particules lentivirales à titre élevé serait très coûteuse. La précipitation de CaPO₄ entraîne des rendements de transfection relativement similaires à ceux obtenus à l’aide de la lipofection. Bien que rentables, les précipitations de CaPO₄ entraînent une mort cellulaire importante après les transfections, ce qui rend difficile la normalisation et évite les variations d’un lot à^{l’autre 17}. Dans ce scénario, le développement d’une méthode qui donne une efficacité de transfection élevée, une faible cytotoxicité et un rapport coût-efficacité est crucial pour la production de particules lentivirales à titre élevé à utiliser dans les CSEh.

La polyéthylèneénamine (PEI) est un polymère cationique qui peut transfecter les cellules HEK293T à haute efficacité sans trop de cytotoxicité et a un coût négligeable par rapport aux méthodes basées sur la lipofection¹⁸. Dans cette situation, PEI peut être utilisé pour des applications à grande échelle de la production de LVS à titre élevé grâce à la concentration de particules lentivirales provenant de surnageants de culture à l’aide de diverses techniques. L’article présenté décrit l’utilisation de l’Î.-P.-É. pour transfecter les cellules HEK293T et la concentration de vecteurs lentiviraux à l’aide de l’ultracentrifugation à travers un coussin de saccharose. En utilisant cette méthode, nous obtenons régulièrement des titres bien au-dessus de 5 x 10⁷ UI / mL avec de faibles variations de lot à lot. La méthode est simple, simple et rentable pour les applications à grande échelle pour l’administration de gènes aux CSEh et aux cellules dérivées des CSEh.

Protocol

1. Transfection de cellules HEK293T à l’aide d’un réactif PEI ou Lipofectamine 3000 Culture de cellules HEK293T dans du DMEM + 10% FBS + 1x pénicilline/streptomycine à 37 °C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% de CO2 et 21 % O2 jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 90% avant l’ensemencement pour la transfection. Utilisez un nombre relativement faible de cellules de passage pour une production élevée de virus à titre élevé (idé…

Representative Results

Après le transfert de gènes, une viabilité élevée des CSEh est inévitablement requise. Malgré les efforts et l’optimisation des protocoles pour réduire la mort cellulaire après l’électroporation des CSEh, plus de 50% de la mort cellulaire est encore observée après l’électroporation de ces cellules, ainsi qu’une faible efficacité de transfection20. Le transfert de gènes à médiation lentivirale entraîne non seulement une grande efficacité du transfert de gènes, mais démo…

Discussion

La capacité de modifier génétiquement les cellules souches à des fins d’étude ou cliniques est limitée à la fois par la technologie et la compréhension de base de la biologie des CSEh. Les techniques qui ont montré un potentiel important dans les CSE de souris, comme la lipofection et l’électroporation, ne sont pas très efficaces pour les CSEh, qui sont notoirement difficiles pour l’administration de gènes par les méthodes conventionnelles²⁰. Cette notion a conduit non seulement…

Materials

2-Mercaptoethanol	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem Cell Technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Bovine serum albumin FRAC V	Invitrogen	15260037
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem Cell Technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM Nutrient mix F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution	GE healthcare	SH30238.01
L Glutamine, 100X	Invitrogen	2924190090
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH shRNA	Macrogen		Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher	L3000001
mTesR1 complete media	Stem Cell Technologies	85850
Neurobasal medium 1X CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Penicillin streptomycin SOL	Invitrogen	15140122
pLKO.1 TRC vector	Addgene	10878
pLL3.7 vector	Addgene	11795
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Purmorphamine	Tocris	4551/10
Puromycin	Invitrogen	A1113802
ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Trypsin .05% EDTA	Invitrogen	25300062
XAV 939	Tocris	3748/10