Lentiviral vermittelte Abgabe von shRNAs an hESCs und NPCs unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI)

Summary

Unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI) produzierten wir lentivirale Partikel für die stabile Expression von shRNAs in H9-humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und transienten H9-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen (NPCs) mit hoher Effizienz.

Abstract

Das aktuelle Protokoll beschreibt die Verwendung von lentiviralen Partikeln für die Abgabe von Kurzhaarnadel-RNAs (shRNAs) sowohl an humane embryonale Stammzellen (hESCs) als auch an neurale Vorläuferzellen (NPCs), die von hESCs mit hoher Effizienz gewonnen werden. Lentivirale Partikel wurden durch Co-Transfizierung von HEK293T-Zellen unter Verwendung von Eintrittsvektoren (mit shRNAs) zusammen mit Verpackungsplasmiden (pAX und pMD2.G) unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI) erzeugt. Viruspartikel wurden mittels Ultrazentrifugation konzentriert, was zu durchschnittlichen Titern über 5 x 10⁷ führte. Sowohl hESCs als auch NPCs konnten mit diesen lentiviralen Partikeln mit hoher Effizienz infiziert werden, wie die Puromycin-Selektion und die stabile Expression in hES-Zellen sowie die vorübergehende GFP-Expression in NPCs zeigen. Darüber hinaus zeigte die Western-Blot-Analyse eine signifikante Verringerung der Expression von Genen, auf die shRNAs abzielen. Darüber hinaus behielten die Zellen ihre Pluripotenz sowie ihr Differenzierungspotenzial bei, was durch ihre anschließende Differenzierung in verschiedene ZNS-Linien belegt wird. Das aktuelle Protokoll befasst sich mit der Abgabe von shRNAs; Der gleiche Ansatz könnte jedoch für die ektopische Expression von cDNAs für Überexpressionsstudien verwendet werden.

Introduction

Humane embryonale Stammzellen (hES-Zellen), die aus der inneren Zellmasse der Blastozyste gewonnen werden, sind pluripotent und können unter In-vitro-Bedingungen in Abhängigkeit von äußeren Faktoren in verschiedene Zelltypen differenziert werden ^1,2. Um das Potenzial von hES-Zellen voll auszuschöpfen, ist es unerlässlich, schnelle und zuverlässige Genabgabemethoden für diese Zellen zu haben. Herkömmlicherweise können die verwendeten Techniken grob in zwei Arten eingeteilt werden: nichtvirale und virale Gen-Delivery-Systeme ^3,4. Die am häufigsten verwendeten nichtviralen Genabgabesysteme sind Lipofektion, Elektroporation und Nukleofektion. Nichtvirale Verabreichungssysteme sind vorteilhaft wegen weniger Insertionsmutationen und einer Gesamtabnahme der Immunogenität ^5,6. Diese Methoden führen jedoch zu einer geringen Transfektionseffizienz und einer kurzen Dauer der transienten Genexpression, was eine große Einschränkung für Langzeitdifferenzierungsstudien darstellt⁷. Elektroporation führt zu besseren Transfektionseffizienzen im Vergleich zur Lipofektion; Es führt jedoch zu mehr als 50% Zelltod ^8,9,10. Mit Hilfe der Nukleofektion können das Zellüberleben und die Transfektionseffizienz durch die Kombination von Lipofektion und Elektroporation verbessert werden, aber der Ansatz erfordert zellspezifische Puffer und spezielle Ausrüstung und wird daher für skalierte Anwendungen ziemlich kostspielig^11,12.

Im Gegensatz dazu haben virale Vektoren verbesserte Transfektionseffizienzen sowie eine insgesamt geringe Zytotoxizität nach der Transduktion gezeigt. Darüber hinaus werden die gelieferten Gene stabil exprimiert und machen diese Methode daher ideal für Langzeitstudien¹³. Zu den am häufigsten verwendeten viralen Vektoren für die Genabgabe in hES-Zellen gehören lentivirale Vektoren (LVS), die eine Transduktionseffizienz von mehr als 80% unter Verwendung von Viruspartikeln mit hohem Titer^{ergeben können 14,15}. Lipofektion und CaPO_4-Fällung gehören zu den am häufigsten verwendeten Methoden, um HEK293T-Zellen oder seine Derivate mit Gentransfervektoren zusammen mit Verpackungsplasmiden vorübergehend zu transfektieren, um lentivirale Partikel^{zu erhalten 16}. Obwohl die Lipofektion zu einer guten Transfektionseffizienz und einer geringen Zytotoxizität führt, wird die Technik durch ihre Kosten behindert, und eine Skalierung auf lentivirale Partikel mit hohem Titer wäre sehr kostspielig. Die CaPO_4-Fällung führt zu relativ ähnlichen Transfektionseffizienzen wie bei der Lipofektion. Obwohl kostengünstig_, führt die CaPO 4-Fällung zu einem signifikanten Zelltod nach Transfektionen, was es schwierig macht, Batch-to-Batch-Variationen zu standardisieren und^{zu vermeiden 17}. In diesem Szenario ist die Entwicklung einer Methode, die eine hohe Transfektionseffizienz, eine geringe Zytotoxizität und Kosteneffizienz bietet, entscheidend für die Herstellung von lentiviralen Partikeln mit hohem Titer, die in hES-Zellen verwendet werden sollen.

Polyethylenimin (PEI) ist ein kationisches Polymer, das HEK293T-Zellen mit hoher Effizienz ohne viel Zytotoxizität transfizieren kann und im Vergleich zu lipofektionsbasierten Methoden vernachlässigbare Kosten verursacht¹⁸. In dieser Situation kann PEI für skalierte Anwendungen der LVS-Produktion mit hohem Titer durch die Konzentration von lentiviralen Partikeln aus Kulturüberständen unter Verwendung verschiedener Techniken verwendet werden. Der vorgestellte Artikel beschreibt die Verwendung von PEI zur Transfizierung von HEK293T-Zellen und die lentivirale Vektorkonzentration mittels Ultrazentrifugation durch ein Saccharosekissen. Mit dieser Methode erhalten wir regelmäßig Titer weit über 5 x 10⁷ IE / ml mit geringen Variationen. Die Methode ist einfach, unkompliziert und kostengünstig für skalierte Anwendungen zur Genabgabe an hES-Zellen und von hESCs abgeleitete Zellen.

Protocol

1. Transfektion von HEK293T-Zellen mit PEI- oder Lipofectamine 3000-Reagenz Kultur HEK293T-Zellen in DMEM + 10% FBS + 1x Penicillin/Streptomycin bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO2 und 21% O2, bis sie zu 90% konfluent sind, bevor sie zur Transfektion ausgesät werden. Verwenden Sie eine relativ niedrige Passageanzahl von Zellen für eine Virusproduktion mit hohem Titer (idealerweise weniger als P30). Samen Sie 4 x 106<…

Representative Results

Nach dem Gentransfer ist unweigerlich eine hohe Lebensfähigkeit von hES-Zellen erforderlich. Trotz der Bemühungen und der Optimierung von Protokollen zur Reduzierung des Zelltods nach der Elektroporation von hES-Zellen wird nach der Elektroporation dieser Zellen immer noch ein Zelltod von mehr als 50% beobachtet, zusammen mit einer niedrigen Transfektionseffizienz20. Der lentiviral vermittelte Gentransfer führt nicht nur zu einer hohen Effizienz des Gentransfers, sondern zeigt auch eine hohe Ze…

Discussion

Die Fähigkeit, Stammzellen für Studien- oder klinische Zwecke genetisch zu verändern, ist sowohl durch die Technologie als auch durch das grundlegende Verständnis der Biologie von hES-Zellen begrenzt. Techniken, die ein signifikantes Potenzial in Maus-ES-Zellen gezeigt haben, wie Liofektion und Elektroporation, sind für hES-Zellen nicht sehr effizient, die für die Genlieferung mit herkömmlichen Methoden notorisch schwierig sind²⁰. Dieser Gedanke hat nicht nur zur Optimierung bestehender Tec…

Materials

2-Mercaptoethanol	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem Cell Technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Bovine serum albumin FRAC V	Invitrogen	15260037
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem Cell Technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM Nutrient mix F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution	GE healthcare	SH30238.01
L Glutamine, 100X	Invitrogen	2924190090
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH shRNA	Macrogen		Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher	L3000001
mTesR1 complete media	Stem Cell Technologies	85850
Neurobasal medium 1X CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Penicillin streptomycin SOL	Invitrogen	15140122
pLKO.1 TRC vector	Addgene	10878
pLL3.7 vector	Addgene	11795
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Purmorphamine	Tocris	4551/10
Puromycin	Invitrogen	A1113802
ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Trypsin .05% EDTA	Invitrogen	25300062
XAV 939	Tocris	3748/10