Lentiviralmediert levering av shRNA til hESC og NPC ved bruk av lavpris kationisk polymerpolyetylenimine (PEI)

Summary

Ved hjelp av lavkost kationisk polymerpolyetylenimine (PEI) produserte vi lentivirale partikler for stabilt uttrykk av shRNA i H9 humane embryonale stamceller (hESCs) og forbigående transducerte H9-avledede nevrale stamceller (NPC) ved høy effektivitet.

Abstract

Den nåværende protokollen beskriver bruken av lentivirale partikler for levering av kort hårnålsRNA (shRNA) til både humane embryonale stamceller (hESC) samt nevrale stamceller (NPC) avledet fra hESCs ved høy effektivitet. Lentivirale partikler ble generert ved å co-transfektere HEK293T-celler ved hjelp av inngangsvektorer (bærer shRNA) sammen med emballasjeplasmider (pAX og pMD2.G) ved bruk av lavpris kationisk polymerpolyetylenimine (PEI). Viruspartikler ble konsentrert ved hjelp av ultrasentrifugering, noe som resulterte i gjennomsnittlige titere over 5 x 10⁷. Både hESC og NPC kan infiseres med høy effektivitet ved bruk av disse lentivirale partiklene, som vist ved puromycinvalg og stabilt uttrykk i hESC, samt forbigående GFP-uttrykk i NPCer. Videre viste western blot-analyse en signifikant reduksjon i uttrykket av gener målrettet av shRNA. I tillegg beholdt cellene sin pluripotens så vel som differensieringspotensial, som det fremgår av deres etterfølgende differensiering i forskjellige linjer av CNS. Den nåværende protokollen omhandler levering av shRNA; Den samme tilnærmingen kan imidlertid brukes til ektopisk ekspresjon av cDNA for overekspresjonsstudier.

Introduction

Humane embryonale stamceller (hESC) avledet fra blastocystens indre cellemasse er pluripotente og kan differensieres til forskjellige celletyper avhengig av eksterne faktorer under in vitro-tilstander ^1,2. For å fullt ut utnytte potensialet til hESCs, er det viktig å ha raske og pålitelige genleveringsmetoder for disse cellene. Konvensjonelt kan teknikkene som brukes grovt klassifiseres i to typer: ikke-smittsomme og virale genleveringssystemer ^3,4. De hyppigere brukte ikke-smittsomme genleveringssystemene er fettinfeksjon, elektroporering og nukleofeksjon. Ikke-miljømessige leveringssystemer er fordelaktige på grunn av færre innsettingsmutasjoner og en generell reduksjon i immunogenisitet ^5,6. Imidlertid resulterer disse metodene i lav transfeksjonseffektivitet og kort varighet av forbigående genuttrykk, noe som er en stor begrensning for langsiktige differensieringsstudier⁷. Elektroporering resulterer i bedre transfeksjonseffektivitet sammenlignet med fettinfeksjon; Det resulterer imidlertid i mer enn 50% celledød ^8,9,10. Ved hjelp av nukleofeksjon kan celleoverlevelsen og transfeksjonseffektiviteten forbedres ved å kombinere fettinfeksjon og elektroporering, men tilnærmingen trenger cellespesifikke buffere og spesialutstyr og blir dermed ganske kostbar for oppskalerte applikasjoner^11,12.

I motsetning til dette har virale vektorer vist forbedret transfeksjonseffektivitet, samt generell lav cytotoksisitet, etter transduksjon. I tillegg er genene som leveres stabilt uttrykt og dermed gjør denne metoden ideell for langsiktige studier¹³. Blant de mest brukte virale vektorene for genlevering i hESC er lentivirale vektorer (LVS), som kan gi mer enn 80% transduksjonseffektivitet ved bruk av høye titerviruspartikler^14,15. Fettinfeksjon og CaPO 4-utfelling er blant de mest brukte metodene for å forbigående transfektere HEK293T-celler eller dets derivater med genoverføringsvektorer sammen med emballasjeplasmider for å gi lentivirale partikler¹⁶. Selv om fettinfeksjon resulterer i god transfeksjonseffektivitet og lav cytotoksisitet, hindres teknikken av kostnadene, og oppskalering for å få høye titer lentivirale partikler vil være svært kostbart. CaPO 4-utfelling resulterer i relativt lik transfeksjonseffektivitet som de som oppnås ved bruk av fettinfeksjon. Selv om_det er kostnadseffektivt, resulterer CaPO 4-utfelling i betydelig celledød etter transfeksjoner, noe som gjør det vanskelig å standardisere og unngå batch-til-batch-variasjoner¹⁷. I dette scenariet er utvikling av en metode som gir høy transfeksjonseffektivitet, lav cytotoksisitet og kostnadseffektivitet avgjørende for produksjon av lentivirale partikler med høy titer som skal brukes i hESC.

Polyetylenimine (PEI) er en kationisk polymer som kan transfektere HEK293T-celler med høy effektivitet uten mye cytotoksisitet og har en ubetydelig kostnad sammenlignet med lipofeksjonsbaserte metoder¹⁸. I denne situasjonen kan PEI brukes til oppskalerte anvendelser av høy titer LVS-produksjon gjennom konsentrasjon av lentivirale partikler fra kultursupernatanter ved hjelp av forskjellige teknikker. Den presenterte artikkelen beskriver bruken av PEI til å transfektere HEK293T-celler og lentivirale vektorkonsentrasjon ved bruk av ultrasentrifugering gjennom en sukrosepute. Ved hjelp av denne metoden får vi regelmessig titere godt over 5 x 10⁷ IE / ml med lave batch-til-batch-variasjoner. Metoden er enkel, rett frem og kostnadseffektiv for oppskalerte applikasjoner for genlevering til hESCs og hESCs-avledede celler.

Protocol

1. Transfeksjon av HEK293T-celler ved bruk av enten PEI eller Lipofectamine 3000 reagens Kultur HEK293T-celler i DMEM + 10% FBS + 1x penicillin / streptomycin ved 37 ° C i en fuktet inkubator med en atmosfære på 5% CO2 og 21% O2 til de er 90% sammenflytende før såing for transfeksjon. Bruk et relativt lavt passasje antall celler for høy titervirusproduksjon (ideelt mindre enn P30). Frø 4 x 106 celler i 10 ml komplett vekstmedium i en 100 mm vevs…

Representative Results

Etter genoverføring er det uunngåelig nødvendig med høy levedyktighet av hESCs. Til tross for innsatsen og optimaliseringen av protokoller for å redusere celledød etter elektroporering av hESCs, observeres fortsatt mer enn 50% celledød etter elektroporering av disse cellene, sammen med lav transfeksjonseffektivitet20. Lentiviralmediert genoverføring resulterer ikke bare i høy effektivitet av genoverføring, men demonstrerer også høye nivåer av celle levedyktighet etter transduksjon. Re…

Discussion

Evnen til å genmodifisere stamceller for studier eller kliniske formål er begrenset både av teknologi og grunnleggende forståelse av biologien til hESCs. Teknikker som har vist betydelig potensial i muse-ESC, som fettinfeksjon og elektroporering, er ikke svært effektive for hESCs, som er notorisk vanskelig for genlevering ved konvensjonelle metoder²⁰. Denne oppfatningen har ført til ikke bare optimalisering av eksisterende teknikker, men også utvikling av nye metoder for økt transfeksjonse…

Materials

2-Mercaptoethanol	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem Cell Technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Bovine serum albumin FRAC V	Invitrogen	15260037
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem Cell Technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM Nutrient mix F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution	GE healthcare	SH30238.01
L Glutamine, 100X	Invitrogen	2924190090
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH shRNA	Macrogen		Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher	L3000001
mTesR1 complete media	Stem Cell Technologies	85850
Neurobasal medium 1X CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Penicillin streptomycin SOL	Invitrogen	15140122
pLKO.1 TRC vector	Addgene	10878
pLL3.7 vector	Addgene	11795
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Purmorphamine	Tocris	4551/10
Puromycin	Invitrogen	A1113802
ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Trypsin .05% EDTA	Invitrogen	25300062
XAV 939	Tocris	3748/10