Lentiviral מתווך אספקה של shRNA ל- hESCs ו- NPCs באמצעות פולימר קטיוני בעלות נמוכה Polyethylenimine (PEI)
Summary
באמצעות שימוש בפולימר קטיוני פולימרי זול פוליאתילן (PEI), ייצרנו חלקיקים לנטי-ויראליים לביטוי יציב של shRNA בתאי גזע עובריים אנושיים H9 (hESCs) ותאי אב עצביים שמקורם ב-H9 (NPCs) שעברו התמרה חולפת ביעילות גבוהה.
Abstract
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בחלקיקים לנטי-ויראליים להעברת רנ”א קצרים (shRNA) הן לתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) והן לתאי אב עצביים (NPCs) המופקים מ-hESCs ביעילות גבוהה. חלקיקים לנטי-ויראליים נוצרו על-ידי טרנספקציה משותפת של תאי HEK293T באמצעות וקטורים של כניסה (הנושאים shRNA) יחד עם פלסמידי אריזה (pAX ו-pMD2.G) תוך שימוש בפולימר קטיוני בעלות נמוכה של פוליאתילן פולימרי קטיוני (PEI). חלקיקים נגיפיים התרכזו באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה, מה שהביא לממוצע טיטרים מעל 5 x 107. גם hESCs וגם NPCs יכולים להיות נגועים ביעילות גבוהה באמצעות חלקיקים לנטי-ויראליים אלה, כפי שמוצג על ידי בחירת פורומיצין וביטוי יציב ב- hESCs, כמו גם ביטוי GFP חולף ב- NPCs. יתר על כן, ניתוח כתמים מערבי הראה ירידה משמעותית בביטוי של גנים הממוקדים על ידי shRNA. בנוסף, התאים שמרו על הפלוריפוטנטיות שלהם כמו גם על פוטנציאל ההתמיינות שלהם, כפי שמעידה ההתמיינות שלהם לאחר מכן לשושלות שונות של מערכת העצבים המרכזית. הפרוטוקול הנוכחי עוסק במסירת shRNA; עם זאת, אותה גישה יכולה לשמש לביטוי חוץ רחמי של cDNAs למחקרי ביטוי יתר.
Introduction
תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) שמקורם במסת התאים הפנימיים של הבלסטוציסט הם פלוריפוטנטיים וניתן להתמיין ביניהם לסוגי תאים שונים בהתאם לגורמים חיצוניים בתנאים חוץ גופיים 1,2. על מנת לרתום באופן מלא את הפוטנציאל של hESCs, חובה על שיטות אספקת גנים מהירות ואמינות עבור תאים אלה. באופן קונבנציונלי, ניתן לסווג את הטכניקות המשמשות באופן נרחב לשני סוגים: מערכות העברת גנים לא ויראליות ונגיפיות 3,4. מערכות העברת הגנים הלא-ויראליות הנפוצות יותר הן שאיבת שומן, אלקטרופורציה וגרעין. מערכות אספקה לא ויראליות הן יתרון בגלל פחות מוטציות בהחדרה וירידה כוללת באימונוגניות 5,6. עם זאת, שיטות אלה גורמות ליעילות טרנספקציה נמוכה ולמשך זמן קצר של ביטוי גנים חולף, המהווה מגבלה עיקרית למחקרי התמיינות ארוכי טווח7. אלקטרופורציה מביאה ליעילות טרנספקציה טובה יותר בהשוואה לשומן שומן; עם זאת, הוא גורם ליותר מ-50% מוות תאישל 8,9,10. באמצעות נוקליאופקציה, ניתן לשפר את הישרדות התאים ואת יעילות הטרנספקציה על ידי שילוב של שאירופדיקציה ואלקטרופורציה, אך הגישה זקוקה למאגרים ספציפיים לתא ולציוד מיוחד, ולכן היא הופכת ליקרה למדי עבור יישומים מוגדלים11,12.
לעומת זאת, וקטורים ויראליים הראו יעילות טרנספקציה משופרת, כמו גם ציטוטוקסיות נמוכה באופן כללי, בעקבות התמרה. בנוסף, הגנים המועברים באים לידי ביטוי יציב, ולכן הופכים את השיטה הזו לאידיאלית למחקרים ארוכי טווח13. בין הווקטורים הנגיפיים הנפוצים ביותר להעברת גנים ל-hESCs הם וקטורים לנטי-ויראליים (LVS), שיכולים לתת יותר מ-80% יעילות בהתמרה באמצעות חלקיקים נגיפיים בעלי טיטר גבוה14,15. שומן ו- CaPO4 משקעים הם בין השיטות הנפוצות ביותר להעברה חולפת של תאי HEK293T או נגזרותיהם עם וקטורים להעברת גנים יחד עם אריזת פלסמידים להפקת חלקיקים לנטיוויראליים16. אף על פי שמניעת שומן גורמת ליעילות טרנספקציה טובה ולציטוטוקסיות נמוכה, הטכניקה נפגעת על ידי עלותה, והתרחבות כדי לקבל חלקיקים גבוהים של טיטר לנטי-ויראלי תהיה יקרה מאוד. משקעי CaPO4 גורמים ליעילות טרנספקציה דומה יחסית לזו המתקבלת באמצעות שאיבת שומן. למרות שהם חסכוניים, משקעי CaPO4 גורמים למוות תאי משמעותי בעקבות טרנספקציות, מה שמקשה על סטנדרטיזציה ולהימנע משינוייםמאצווה לאצווה 17. בתרחיש זה, פיתוח שיטה המעניקה יעילות טרנספקציה גבוהה, ציטוטוקסיות נמוכה וחסכוניות הוא חיוני לייצור חלקיקים לנטי-ויראליים גבוהים שישמשו ב-hESCs.
Polyethylenimine (PEI) הוא פולימר קטיוני שיכול לבצע טרנספקטציה של תאי HEK293T ביעילות גבוהה ללא ציטוטוקסיות רבה ובעלות זניחה בהשוואה לשיטות מבוססות שאיבת שומן18. במצב זה, PEI יכול לשמש ליישומים מוגדלים של ייצור LVS טיטר גבוה באמצעות ריכוז של חלקיקים lentiviral מסופרנאטים של תרבית באמצעות טכניקות שונות. המאמר המוצג מתאר את השימוש ב-PEI כדי לבצע טרנספקטציה של תאי HEK293T וריכוז וקטורים לנטי-ויראליים באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה דרך כרית סוכרוז. באמצעות שיטה זו, אנו מקבלים באופן קבוע titers הרבה מעל 5 x 107 IU / mL עם וריאציות נמוכות של אצווה לאצווה. השיטה היא פשוטה, ישרה וחסכונית עבור יישומים מוגדלים להעברת גנים ל-hESCs ולתאים שמקורם ב-hESCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
היכולת לשנות גנטית תאי גזע למטרות מחקר או קליניות מוגבלת הן על ידי הטכנולוגיה והן על ידי ההבנה הבסיסית של הביולוגיה של hESCs. טכניקות שהראו פוטנציאל משמעותי ב-ESCs של עכברים, כמו דלקת שומן ואלקטרופורציה, אינן יעילות במיוחד עבור hESCs, אשר ידועים לשמצה כקשים להעברת גנים בשיטות קונבנציונליות<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר מאוניברסיטת איחוד האמירויות הערביות (UAEU), מענק # 31R170 (מרכז זאיד למדעי הבריאות) ו # 12R010 (מענק UAEU-AUA). אנו מודים לפרופ’ רנדל מורס (מרכז וודסוורת’, אולבני, ניו יורק) על שעזר לנו לערוך את כתב היד לסגנון ולדקדוק.
כל הנתונים זמינים על פי בקשה.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 31350010 | |
| 38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| bFGF Recombinant human | Invitrogen | PHG0261 | |
| Bovine serum albumin FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | |
| Cyclopamine | Stem Cell Technologies | 72074 | |
| DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM Nutrient mix F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Fetal bovie serum | Invitrogen | 10270106 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody | CST | 2118S | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
| L Glutamine, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2HGDH Polyclonal antibody | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
| mTesR1 complete media | Stem Cell Technologies | 85850 | |
| Neurobasal medium 1X CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 Supplement 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Supplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Penicillin streptomycin SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pLKO.1 TRC vector | Addgene | 10878 | |
| pLL3.7 vector | Addgene | 11795 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Polybrene infection reagent | Sigma | TR1003- G | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Purmorphamine | Tocris | 4551/10 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride |
Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Trypsin .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro. Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).
- Strulovici, Y., Leopold, P. L., O’Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. Human embryonic stem cells and gene therapy. Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).
- Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering. Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).
- Li, S. D., Huang, L. Nonviral is superior to viral gene delivery. Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).
- Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses. Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).
- Sukhorukov, V. L., et al. Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion. The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).
- Floch, V., et al. Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells. Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).
- Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).
- Zhang, X., Godbey, W. T. Viral vectors for gene delivery in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
- Gropp, M., et al. Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors. Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).
- Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).
- Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. Production of lentiviral vectors. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 3, 16017 (2016).
- Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Göpferich, A. Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
- Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).
- Weissinger, F., et al. Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).
- Cui, Y., et al. Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood. 99 (2), 399-408 (2002).
- Yu, X., et al. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).
- Sweeney, N. P., Vink, C. A. The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 21, 574-584 (2021).
