慢病毒介导的shRNA递送到hESC和NPC，使用低成本阳离子聚合物聚乙亚胺（PEI）
Summary
利用低成本的阳离子聚合物聚乙氨基亚胺（PEI），我们生产了慢病毒颗粒，用于H9人胚胎干细胞（hESCs）中shRNA的稳定表达，并高效瞬时转导H9衍生的神经祖细胞（NPC）。
Abstract
目前的方案描述了使用慢病毒颗粒以高效率将短发夹RNA（shRNA）递送到人胚胎干细胞（hESCs）以及来自hESCs的神经祖细胞（NPC）。通过使用进入载体（携带shRNA）共转染HEK293T细胞以及使用低成本阳离子聚合物聚乙基亚胺（PEI）的包装质粒（pAX和pMD2.G）来生成慢病毒颗粒。使用超速离心浓缩病毒颗粒，这导致平均滴度高于5×107。hESCs和NPC都可以使用这些慢病毒颗粒高效感染，如嘌呤霉素的选择和在hESCs中的稳定表达以及NPC中的瞬时GFP表达所示。此外，蛋白质印迹分析显示，shRNA靶向基因的表达显著降低。此外，这些细胞保留了它们的多能性和分化潜力，正如它们随后分化成不同的CNS谱系所证明的那样。目前的协议涉及shRNA的交付;然而，相同的方法可用于cDNA的异位表达以进行过表达研究。
Introduction
来自囊胚内细胞团的人胚胎干细胞（hESCs）是多能的，可以根据 体外 条件下的外部因素分化成不同的细胞类型1，2。为了充分利用hESC的潜力，必须为这些细胞提供快速可靠的基因递送方法。传统上，所使用的技术大致可分为两种类型：非病毒和病毒基因递送系统3，4。更常用的非病毒基因递送系统是脂质感染、电穿孔和细胞核感染。非病毒递送系统是有利的，因为插入突变较少，免疫原性总体上降低5，6。然而，这些方法导致转染效率低下和瞬时基因表达持续时间短，这是长期分化研究的主要限制7.与脂质感染相比，电穿孔可提高转染效率。然而，它导致超过50%的细胞死亡8，9，10。使用细胞核感染，可以通过结合脂质感染和电穿孔来提高细胞存活率和转染效率，但该方法需要细胞特异性缓冲液和专用设备，因此，对于放大应用来说，成本相当高11，12。
相比之下，病毒载体在转导后显示出更好的转染效率以及整体低细胞毒性。此外，递送的基因稳定表达，因此，这种方法非常适合长期研究13。将基因递送到hESC中最常用的病毒载体是慢病毒载体（LVS），使用高滴度病毒颗粒14，15可以提供超过80%的转导效率。脂质法转染和CaPO4 沉淀是瞬时转染HEK293T细胞或其衍生物以及具有基因转移载体的包装质粒以产生慢病毒颗粒16的最常用方法之一。虽然脂肪法感染具有良好的转染效率和低细胞毒性，但该技术受到其成本的阻碍，并且扩大规模以获得高滴度的慢病毒颗粒将非常昂贵。CaPO4 沉淀的转染效率与使用脂质法的转染效率相对相似。尽管CaPO4 沉淀具有成本效益，但在转染后会导致明显的细胞死亡，这使得标准化和避免批次间差异变得困难17.在这种情况下，开发一种具有高转染效率，低细胞毒性和成本效益的方法对于生产用于hESC的高滴度慢病毒颗粒至关重要。
聚乙基亚胺（PEI）是一种阳离子聚合物，可以高效率转染HEK293T细胞而没有太大的细胞毒性，并且与基于脂质感染的方法相比，成本可以忽略不计18。在这种情况下，PEI可用于通过使用各种技术从培养上清液中浓缩慢病毒颗粒来生产高滴度LVS的放大应用。本文介绍了使用 PEI 转染 HEK293T 细胞，以及通过蔗糖缓冲液进行超速离心的慢病毒载体浓缩。使用这种方法，我们定期获得远高于5 x 107 IU / mL的滴度，并且批次间差异很小。该方法简单，直接且具有成本效益，适用于将基因递送到hESC和hESCs衍生细胞的放大应用。
Protocol
Representative Results
Discussion
出于研究或临床目的对干细胞进行基因修饰的能力受到技术和对hESCs生物学的基本理解的限制。在小鼠ESC中显示出巨大潜力的技术，如脂质渗透和电穿孔，对hESCs来说效率不高，众所周知，hESCs很难通过常规方法进行基因传递20。这一概念不仅优化了现有技术，还开发了提高hESC转染效率的新方法。这些新发展的重点是高效和稳定的基因递送到hESC，同时在很长一段时间内保持对hESC?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了阿拉伯联合酋长国大学（UAEU）的研究资助，赠款#31R170（扎耶德健康科学中心）和#12R010（UAEU-AUA赠款）的支持。我们感谢兰德尔·莫尔斯教授（纽约州奥尔巴尼沃兹沃思中心）帮助我们编辑手稿的风格和语法。
所有数据均可根据要求提供。
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 31350010 | |
| 38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| bFGF Recombinant human | Invitrogen | PHG0261 | |
| Bovine serum albumin FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | |
| Cyclopamine | Stem Cell Technologies | 72074 | |
| DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM Nutrient mix F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Fetal bovie serum | Invitrogen | 10270106 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody | CST | 2118S | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
| L Glutamine, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2HGDH Polyclonal antibody | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
| mTesR1 complete media | Stem Cell Technologies | 85850 | |
| Neurobasal medium 1X CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 Supplement 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Supplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Penicillin streptomycin SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pLKO.1 TRC vector | Addgene | 10878 | |
| pLL3.7 vector | Addgene | 11795 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Polybrene infection reagent | Sigma | TR1003- G | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Purmorphamine | Tocris | 4551/10 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride |
Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Trypsin .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
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