Niet-invasieve PET/MR-beeldvorming in een orthotopisch muismodel van hepatocellulair carcinoom
Summary
Hier presenteren we een protocol om orthotopische hepatocellulaire carcinoom xenografts met en zonder ligatie van de leverslagader te creëren en niet-invasieve positronemissietomografie (PET) beeldvorming van tumorhypoxie uit te voeren met behulp van [18 F] Fluoromisonidazol ([18 F] FMISO) en [18 F] Fluorodeoxyglucose ([18F] FDG).
Abstract
Preklinische experimentele modellen van hepatocellulair carcinoom (HCC) die menselijke ziekten samenvatten, vormen een belangrijk hulpmiddel om tumorigenese te bestuderen en nieuwe therapeutische benaderingen te evalueren. Niet-invasieve beeldvorming van het hele lichaam met behulp van positronemissietomografie (PET) biedt kritische inzichten in de in vivo kenmerken van weefsels op moleculair niveau in realtime. We presenteren hier een protocol voor orthotopische HCC xenograft creatie met en zonder hepatische arterie ligatie (HAL) om tumorhypoxie te induceren en de beoordeling van hun tumormetabolisme in vivo met behulp van [18 F] Fluoromisonidazol ([18 F] FMISO) en [18 F] Fluorodeoxyglucose ([18F] FDG) PET / magnetische resonantie (MR) beeldvorming. Tumorhypoxie kon gemakkelijk worden gevisualiseerd met behulp van de hypoxiemarker [18 F] FMISO, en het bleek dat de [18 F] FMISO-opname hoger was bij HCC-muizen die HAL ondergingen dan in de niet-HAL-groep, terwijl [18F] FDG geen tumorhypoxie tussen de twee groepen kon onderscheiden. HAL-tumoren vertoonden ook een hoger niveau van hypoxie-induceerbare factor (HIF)-1α-expressie als reactie op hypoxie. Kwantificering van HAL-tumoren toonde een 2,3-voudige toename in [18F] FMISO-opname op basis van de gestandaardiseerde waardeopname (SUV) -benadering.
Introduction
Hepatocellulair carcinoom (HCC) is de zesde meest gediagnosticeerde kanker en de derde meest voorkomende doodsoorzaak van kanker wereldwijd, met meer dan 900.000 nieuwe gevallen en 800.000 sterfgevallen in 20201. De belangrijkste risicofactor is cirrose, die optreedt als gevolg van virale infecties (hepatitis B- en C-virussen), alcoholmisbruik, diabetes en niet-alcoholische steatohepatitis2. Het beheer van HCC is vrij complex en er zijn verschillende behandelingsopties beschikbaar, waaronder chirurgische resectie, thermische of chemische ablatie, transplantatie, transarteriële chemo-embolisatie, bestraling en chemotherapie, afhankelijk van de stadiëring van de ziekte 2,3. HCC is een chemotherapie-refractaire tumor met een recidief van de ziekte bij maximaal 70% van de patiënten na curatieve behandeling2.
Ondanks de hoge mate van tumorheterogeniteit is HCC geassocieerd met twee veel voorkomende uitkomsten: (i) HCC is zeer hypoxisch en (ii) tumorhypoxie is gekoppeld aan grotere tumoragressiviteit en behandelingsfalen. De ongecontroleerde proliferatie van HCC-cellen resulteert in een hoog zuurstofverbruik dat voorafgaat aan vascularisatie, waardoor een hypoxische micro-omgeving ontstaat. Lage intra-tumorale zuurstofniveaus veroorzaken vervolgens een reeks biologische reacties die de agressiviteit van de tumor en de behandelingsrespons beïnvloeden. Hypoxie-induceerbare factoren (HIF’s) worden vaak erkend als de essentiële transcriptionele regulatoren in de respons op hypoxie 2,3. Daarom is het vermogen om hypoxie te detecteren cruciaal om neoplastische weefsels te visualiseren en de ontoegankelijke plaatsen te identificeren, die invasieve procedures vereisen. Het helpt ook om de moleculaire veranderingen die leiden tot tumoragressiviteit beter te begrijpen en de behandelingsresultaten van de patiënt te verbeteren.
Moleculaire beeldvorming met behulp van positronemissietomografie (PET) wordt vaak gebruikt bij de diagnose en stadiëring van veel kankers, waaronder HCC. Met name het gecombineerde gebruik van dual-tracer PET-beeldvorming met [18 F]Fluorodeoxyglucose ([18F]FDG) en [11C]Acetaat kan de algehele gevoeligheid bij HCC-diagnose aanzienlijk verhogen 4,5. Beeldvorming van hypoxie, aan de andere kant, kan worden bereikt met behulp van de veelgebruikte hypoxische marker [18 F] Fluoromisonidazol ([18F] FMISO). In de klinische praktijk is de niet-invasieve beoordeling van hypoxie belangrijk om onderscheid te maken tussen verschillende soorten tumoren en regio’s voor radiotherapieplanning6.
Preklinische beeldvorming is een onmisbaar hulpmiddel geworden voor de niet-invasieve en longitudinale evaluatie van muismodellen voor verschillende ziekten. Een robuust en zeer reproduceerbaar HCC-model vormt een belangrijk platform voor preklinisch en translationeel onderzoek naar de pathofysiologie van menselijke HCC en de beoordeling van nieuwe therapieën. Samen met PET-beeldvorming kunnen in vivo gedragingen worden opgehelderd om belangrijke inzichten op moleculair niveau te bieden voor een bepaald tijdspunt. Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van hepatische arterieligatie (HAL) orthotopische HCC-xenografts en analyse van hun in vivo tumormetabolisme met behulp van [18 F] FMISO en [18F] FDG PET / MR. De integratie van HAL maakt een geschikt model van transgene of chemisch geïnduceerde HCC-muizen xenografts om tumorhypoxie in vivo te bestuderen, omdat HAL de arteriële bloedtoevoer effectief kan blokkeren om intratumorale hypoxie te induceren 7,8. Bovendien kunnen, in tegenstelling tot ex vivo immunohistochemische kleuring met pimonidazol, veranderingen in het tumormetabolisme als gevolg van hypoxie gemakkelijk worden gevisualiseerd en nauwkeurig niet-invasief worden gekwantificeerd met behulp van PET-beeldvorming, waardoor longitudinale beoordeling van de behandelingsrespons of meting van het ontstaan van resistentie mogelijk is 3,7,8 . Onze hier getoonde methode maakt het mogelijk om een robuust hypoxisch HCC-model te maken, samen met niet-invasieve monitoring van tumorhypoxie met behulp van PET / MR-beeldvorming om HCC-biologie in vivo te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie beschreven we de procedures om HAL uit te voeren op leverorthotopische HCC-xenografts met behulp van subcutane tumoren, samen met methoden voor de niet-invasieve monitoring van tumorhypoxie in orthotopische xenografts met behulp van [18 F] FMISO en [18F] FDG PET / MR. Onze interesse ligt in de metabole beeldvorming van verschillende kanker- en ziektemodellen voor vroege diagnose en evaluatie van de behandelingsrespons11,13,14,15</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen de steun van het Hong Kong Anticancer Trust Fund, Hong Kong Research Grants Council Collaborative Research Fund (CRF C7018-14E) voor de beeldvormingsexperimenten met kleine dieren. We danken ook de steun van het Molecular Imaging and Medical Cyclotron Center (MIMCC) aan de Universiteit van Hong Kong voor de levering van [18 F] FMISO en [18F] FDG.
Materials
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Chen, C., Lou, T. Hypoxia inducible factors in hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 8 (28), 46691-46703 (2017).
- Lu, R. -. C., et al. Positron-emission tomography for hepatocellular carcinoma: Current status and future prospects. World Journal of Gastroenterology. 25 (32), 4682-4695 (2019).
- Larsson, P., et al. Adding 11C-acetate to 18F-FDG at PET examination has an incremental value in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Molecular Imaging and Radionuclide Therapy. 21 (1), 6-12 (2012).
- Huo, L., et al. Kinetic analysis of dynamic 11C-acetate PET/CT imaging as a potential method for differentiation of hepatocellular carcinoma and benign liver lesions. Theranostics. 5 (4), 371-377 (2015).
- Lopci, E., et al. PET radiopharmaceuticals for imaging of tumor hypoxia: A review of the evidence. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 4 (4), 365-384 (2014).
- Mao, X., et al. Mechanisms through which hypoxia-induced caveolin-1 drives tumorigenesis and metastasis in hepatocellular carcinoma. Cancer Research. 76 (24), 7242-7253 (2016).
- Kung-Chun Chiu, D., et al. Hypoxia regulates the mitochondrial activity of hepatocellular carcinoma cells through HIF/HEY1/PINK1 pathway. Cell Death & Disease. 10 (12), 934 (2019).
- Li, Y., et al. Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97. World Journal of Gastroenterology. 7 (5), 630-636 (2001).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42 (6), 217-224 (2013).
- Liu, Q., Tan, K. V., Chang, H. C., Khong, P. L., Hui, X. Visualization and quantification of brown and beige adipose tissues in mice using [18F] FDG micro-PET/MR imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (173), e62460 (2021).
- Lin, W. -. H., et al. Hypoxia-activated cytotoxic agent tirapazamine enhances hepatic artery ligation-induced killing of liver tumor in HBx transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11937-11942 (2016).
- Wong, T. L., et al. CRAF methylation by PRMT6 regulates aerobic glycolysis-driven hepatocarcinogenesis via ERK-dependent PKM2 nuclear relocalization and activation. Hepatology. 71 (4), 1279-1296 (2020).
- Yang, X., et al. Development of cisplatin-loaded hydrogels for trans-portal vein chemoembolization in an orthotopic liver cancer mouse model. Drug Delivery. 28 (1), 520-529 (2021).
- Shi, J., et al. Longitudinal evaluation of five nasopharyngeal carcinoma animal models on the microPET/MR platform. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (5), 1497-1507 (2021).
- Kilian, K., et al. Imaging of hypoxia in small animals with F fluoromisonidasole. Nukleonika. 61 (2), 219-223 (2016).
- Kawamura, M., et al. Evaluation of optimal post-injection timing of hypoxic imaging with 18F-Fluoromisonidazole-PET/CT. Molecular Imaging and Biology. 23 (4), 597-603 (2021).
