Imaging PET/RM non invasivo in un modello murino ortotopico di carcinoma epatocellulare
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per creare xenotrapianti di carcinoma epatocellulare ortotopico con e senza legatura dell’arteria epatica ed eseguire la tomografia ad emissione di positroni (PET) non invasiva dell’ipossia tumorale utilizzando [18 F]Fluoromisonidazolo ([18 F]FMISO) e [18 F]Fluorodesossiglucosio ([18F]FDG).
Abstract
I modelli sperimentali preclinici di carcinoma epatocellulare (HCC) che ricapitolano la malattia umana rappresentano uno strumento importante per studiare la tumorigenesi e valutare nuovi approcci terapeutici. L’imaging non invasivo di tutto il corpo utilizzando la tomografia ad emissione di positroni (PET) fornisce informazioni critiche sulle caratteristiche in vivo dei tessuti a livello molecolare in tempo reale. Presentiamo qui un protocollo per la creazione di xenotrapianto ortotopico HCC con e senza legatura dell’arteria epatica (HAL) per indurre ipossia tumorale e la valutazione del loro metabolismo tumorale in vivo utilizzando [18 F]Fluoromisonidazolo ([18 F]FMISO) e [18 F]Fluorodesossiglucosio ([18F]FDG) PET / risonanza magnetica (MR). L’ipossia tumorale poteva essere facilmente visualizzata usando il marcatore di ipossia [18 F] FMISO, e si è scoperto che l’assorbimento di [18 F] FMISO era più alto nei topi HCC sottoposti a HAL rispetto al gruppo non-HAL, mentre [18F] FDG non poteva distinguere l’ipossia tumorale tra i due gruppi. I tumori HAL hanno anche mostrato un livello più elevato di espressione del fattore inducibile dall’ipossia (HIF)-1α in risposta all’ipossia. La quantificazione dei tumori HAL ha mostrato un aumento di 2,3 volte nell’assorbimento di [18F] FMISO basato sull’approccio standardizzato di assorbimento del valore (SUV).
Introduction
Il carcinoma epatocellulare (HCC) è il sesto tumore più diagnosticato e la terza causa più comune di morte per cancro in tutto il mondo, con oltre 900.000 nuovi casi e 800.000 decessi nel 20201. Il principale fattore di rischio è la cirrosi, che si verifica a seguito di infezioni virali (virus dell’epatite B e C), abuso di alcol, diabete e steatoepatite non alcolica2. La gestione dell’HCC è piuttosto complessa e sono disponibili diverse opzioni di trattamento, tra cui resezione chirurgica, ablazione termica o chimica, trapianto, chemioembolizzazione transarteriosa, radiazioni e chemioterapia, a seconda della stadiazione della malattia 2,3. L’HCC è un tumore refrattario alla chemioterapia con recidiva della malattia fino al 70% dei pazienti che seguono una terapia curativa2.
Nonostante l’elevato grado di eterogeneità tumorale, l’HCC è associato a due esiti comuni: (i) l’HCC è molto ipossico e (ii) l’ipossia tumorale è legata a una maggiore aggressività del tumore e al fallimento del trattamento. La proliferazione incontrollata delle cellule HCC si traduce in un alto tasso di consumo di ossigeno che precede la vascolarizzazione, creando così un microambiente ipossico. Bassi livelli di ossigeno intratumorale innescano quindi una serie di risposte biologiche che influenzano l’aggressività del tumore e la risposta al trattamento. I fattori inducibili dall’ipossia (HIF) sono spesso riconosciuti come i regolatori trascrizionali essenziali nella risposta all’ipossia 2,3. Quindi, la capacità di rilevare l’ipossia è fondamentale per visualizzare i tessuti neoplastici e identificare i siti inaccessibili, che richiedono procedure invasive. Aiuta anche a comprendere meglio i cambiamenti molecolari che portano all’aggressività del tumore e migliorare i risultati del trattamento del paziente.
L’imaging molecolare mediante tomografia ad emissione di positroni (PET) è comunemente usato nella diagnosi e nella stadiazione di molti tumori, incluso l’HCC. In particolare, l’uso combinato dell’imaging PET a doppio tracciante che coinvolge [18 F]fluorodesossiglucosio ([18F]FDG) e [11C]acetato può aumentare significativamente la sensibilità complessiva nella diagnosi di HCC 4,5. L’imaging dell’ipossia, d’altra parte, può essere ottenuto utilizzando il marcatore ipossico comunemente usato [18 F] Fluoromisonidazolo ([18F] FMISO). Nella pratica clinica, la valutazione non invasiva dell’ipossia è importante per differenziare tra vari tipi di tumori e regioni per la pianificazione della radioterapia6.
L’imaging preclinico è diventato uno strumento indispensabile per la valutazione non invasiva e longitudinale di modelli murini per diverse malattie. Un modello di HCC robusto e altamente riproducibile rappresenta un’importante piattaforma per la ricerca preclinica e traslazionale sulla fisiopatologia dell’HCC umano e la valutazione di nuove terapie. Insieme all’imaging PET, i comportamenti in vivo possono essere chiariti per fornire importanti informazioni a livello molecolare per un dato punto temporale. Qui, descriviamo un protocollo per la generazione di xenotrapianti HCC ortotopici di legatura dell’arteria epatica (HAL) e l’analisi del loro metabolismo tumorale in vivo utilizzando [18 F]FMISO e [18F]FDG PET/MR. L’incorporazione di HAL rende un modello adatto di xenotrapianti di topi HCC transgenici o indotti chimicamente per studiare l’ipossia tumorale in vivo, poiché HAL può bloccare efficacemente l’afflusso di sangue arterioso per indurre ipossia intratumorale 7,8. Inoltre, a differenza della colorazione immunoistochimica ex vivo con pimonidazolo, i cambiamenti nel metabolismo tumorale a seguito di ipossia possono essere facilmente visualizzati e quantificati con precisione in modo non invasivo utilizzando l’imaging PET, consentendo la valutazione longitudinale della risposta al trattamento o la misurazione dell’emergenza di resistenza 3,7,8 . Il nostro metodo mostrato qui consente la creazione di un robusto modello di HCC ipossico insieme al monitoraggio non invasivo dell’ipossia tumorale utilizzando l’imaging PET / MR per studiare la biologia dell’HCC in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, abbiamo descritto le procedure per eseguire HAL su xenotrapianti ortotopici HCC epatici utilizzando tumori sottocutanei, insieme a metodi per il monitoraggio non invasivo dell’ipossia tumorale negli xenotrapianti ortotopici utilizzando [18 F] FMISO e [18F] FDG PET / MR. Il nostro interesse risiede nell’imaging metabolico di vari modelli di cancro e malattia per la diagnosi precoce e la valutazione della risposta al trattamento11,13,14,15<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo il sostegno dell’Hong Kong Anticancer Trust Fund, Hong Kong Research Grants Council Collaborative Research Fund (CRF C7018-14E) per gli esperimenti di imaging di piccoli animali. Ringraziamo anche il supporto del Molecular Imaging and Medical Cyclotron Center (MIMCC) presso l’Università di Hong Kong per la fornitura di [18 F]FMISO e [18F]FDG.
Materials
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Chen, C., Lou, T. Hypoxia inducible factors in hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 8 (28), 46691-46703 (2017).
- Lu, R. -. C., et al. Positron-emission tomography for hepatocellular carcinoma: Current status and future prospects. World Journal of Gastroenterology. 25 (32), 4682-4695 (2019).
- Larsson, P., et al. Adding 11C-acetate to 18F-FDG at PET examination has an incremental value in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Molecular Imaging and Radionuclide Therapy. 21 (1), 6-12 (2012).
- Huo, L., et al. Kinetic analysis of dynamic 11C-acetate PET/CT imaging as a potential method for differentiation of hepatocellular carcinoma and benign liver lesions. Theranostics. 5 (4), 371-377 (2015).
- Lopci, E., et al. PET radiopharmaceuticals for imaging of tumor hypoxia: A review of the evidence. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 4 (4), 365-384 (2014).
- Mao, X., et al. Mechanisms through which hypoxia-induced caveolin-1 drives tumorigenesis and metastasis in hepatocellular carcinoma. Cancer Research. 76 (24), 7242-7253 (2016).
- Kung-Chun Chiu, D., et al. Hypoxia regulates the mitochondrial activity of hepatocellular carcinoma cells through HIF/HEY1/PINK1 pathway. Cell Death & Disease. 10 (12), 934 (2019).
- Li, Y., et al. Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97. World Journal of Gastroenterology. 7 (5), 630-636 (2001).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42 (6), 217-224 (2013).
- Liu, Q., Tan, K. V., Chang, H. C., Khong, P. L., Hui, X. Visualization and quantification of brown and beige adipose tissues in mice using [18F] FDG micro-PET/MR imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (173), e62460 (2021).
- Lin, W. -. H., et al. Hypoxia-activated cytotoxic agent tirapazamine enhances hepatic artery ligation-induced killing of liver tumor in HBx transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11937-11942 (2016).
- Wong, T. L., et al. CRAF methylation by PRMT6 regulates aerobic glycolysis-driven hepatocarcinogenesis via ERK-dependent PKM2 nuclear relocalization and activation. Hepatology. 71 (4), 1279-1296 (2020).
- Yang, X., et al. Development of cisplatin-loaded hydrogels for trans-portal vein chemoembolization in an orthotopic liver cancer mouse model. Drug Delivery. 28 (1), 520-529 (2021).
- Shi, J., et al. Longitudinal evaluation of five nasopharyngeal carcinoma animal models on the microPET/MR platform. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (5), 1497-1507 (2021).
- Kilian, K., et al. Imaging of hypoxia in small animals with F fluoromisonidasole. Nukleonika. 61 (2), 219-223 (2016).
- Kawamura, M., et al. Evaluation of optimal post-injection timing of hypoxic imaging with 18F-Fluoromisonidazole-PET/CT. Molecular Imaging and Biology. 23 (4), 597-603 (2021).
