肝細胞癌の同所性モデルマウスにおける非侵襲的PET/MRイメージング
Summary
ここでは、肝動脈結紮の有無にかかわらず同所性肝細胞癌異種移植片を作成し、[18 F]フルオロミソニダゾール([18 F]FMISO)および[18 F]フルオロデオキシグルコース([18F]FDG)を使用して腫瘍低酸素症の非侵襲的陽電子放出断層撮影(PET)を行うためのプロトコルを提示します。
Abstract
ヒト疾患を再現する肝細胞癌(HCC)の前臨床実験モデルは、腫瘍形成を研究し、新しい治療アプローチを評価するための重要なツールとなります。陽電子放出断層撮影(PET)を使用した非侵襲的な全身イメージングは、組織のin vivo特性に関する重要な洞察を分子レベルでリアルタイムで提供します。ここでは、腫瘍低酸素症を誘発するための肝動脈結紮(HAL)の有無にかかわらず、同所性HCC異種移植片を作成するためのプロトコルと、[18 F]フルオロミソニダゾール([18 F]FMISO)および[18F]フルオロデオキシグルコース([18F]FDG)PET /磁気共鳴(MR)イメージングを使用したin vivoでの腫瘍代謝の評価を紹介します。腫瘍低酸素症は、低酸素マーカー[18 F]FMISOを使用して容易に視覚化でき、[18 F]FMISOの取り込みは、HALを受けたHCCマウスで非HAL群よりも高かったが、[18F]FDGは2つのグループ間で腫瘍低酸素症を区別できなかったことがわかりました。HAL腫瘍はまた、低酸素に応答してより高いレベルの低酸素誘導因子(HIF)-1α発現を示した。HAL腫瘍の定量化は、標準化値取り込み(SUV)アプローチに基づく[18F]FMISO取り込みの2.3倍の増加を示した。
Introduction
肝細胞がん(HCC)は、世界で6番目に診断されたがんであり、がんによる死因として3番目に多く、2020年には90万人以上の新規症例と80万人以上の死亡があります1。主な危険因子は肝硬変であり、これはウイルス感染(B型およびC型肝炎ウイルス)、アルコール乱用、糖尿病、および非アルコール性脂肪性肝炎2の結果として発生します。HCCの管理はかなり複雑であり、疾患の病期分類に応じて、外科的切除、熱的または化学的アブレーション、移植、経動脈化学塞栓術、放射線、化学療法など、いくつかの治療オプションが利用可能です2,3。HCCは化学療法に難治性の腫瘍であり、治癒目的の治療を受けた患者の最大70%に疾患が再発します2。
高度の腫瘍の不均一性にもかかわらず、HCCは2つの一般的な結果に関連しています:(i)HCCは非常に低酸素であり、(ii)腫瘍低酸素症は腫瘍の攻撃性および治療の失敗の増加に関連しています。HCC細胞の制御されない増殖は、血管新生に先行する高い酸素消費率をもたらし、したがって低酸素微小環境を作り出す。腫瘍内酸素レベルが低いと、腫瘍の攻撃性と治療反応に影響を与えるさまざまな生物学的反応が引き起こされます。低酸素誘導因子(HIF)は、低酸素症への応答において必須の転写調節因子として認識されることがよくあります2,3。したがって、低酸素症を検出する能力は、腫瘍性組織を視覚化し、侵襲的な手順を必要とするアクセスできない部位を特定するために重要です。また、腫瘍の攻撃性につながる分子変化をよりよく理解し、患者の治療結果を改善するのにも役立ちます。
陽電子放出断層撮影(PET)を使用した分子イメージングは、HCCを含む多くの癌の診断と病期分類に一般的に使用されています。特に、[18 F]フルオロデオキシグルコース([18F]FDG)と[11C]アセテートを含むデュアルトレーサーPETイメージングを組み合わせて使用すると、HCC診断における全体的な感度が大幅に向上する可能性があります4,5。一方、低酸素症のイメージングは、一般的に使用される低酸素マーカー[18 F]フルオロミソニダゾール([18F]FMISO)を使用して達成できます。臨床診療では、低酸素症の非侵襲的評価は、放射線治療計画のためにさまざまな種類の腫瘍と領域を区別するために重要です6。
前臨床イメージングは、さまざまな疾患のマウスモデルの非侵襲的および縦断的評価に不可欠なツールになっています。堅牢で再現性の高いHCCモデルは、ヒトHCCの病態生理学および新規治療法の評価に関する前臨床およびトランスレーショナル研究のための重要なプラットフォームです。PETイメージングとともに、in vivoの挙動を解明して、任意の時点で分子レベルで重要な洞察を提供することができます。ここでは、[18F]FMISOおよび[18F]FDG PET/MRを使用した肝動脈結紮(HAL)同所性HCC異種移植片の生成とそれらのin vivo腫瘍代謝の分析のためのプロトコルについて説明します。HALの組み込みは、HALが腫瘍内低酸素症を誘発するために動脈血供給を効果的に遮断することができるので、in vivoで腫瘍低酸素症を研究するためのトランスジェニックまたは化学的に誘導されたHCCマウス異種移植片の適切なモデルを作る7,8。さらに、ピモニダゾールを用いたex vivo免疫組織化学染色とは異なり、低酸素の結果としての腫瘍代謝の変化は、PETイメージングを使用して非侵襲的に容易に視覚化および正確に定量することができ、治療反応の縦断的評価または耐性の出現の測定を可能にします3,7,8.ここに示す方法は、PET/MRイメージングを用いた腫瘍低酸素の非侵襲的モニタリングとともに、堅牢な低酸素HCCモデルの作成を可能にし、in vivoでのHCC生物学を研究することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では,皮下腫瘍を用いた肝同所性HCC異種移植片のHAL実施手順と,[18F]FMISOおよび[18F]FDG PET/MRを用いた同所性異所性異種移植片における腫瘍低酸素症の非侵襲的モニタリング方法について説明しました。私たちの関心は、早期診断と治療反応評価のためのさまざまな癌および疾患モデルの代謝イメージングにあります11,13,14,15</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、小動物イメージング実験のための香港抗がん信託基金、香港研究助成評議会共同研究基金(CRF C7018-14E)の支援に感謝します。また、[18 F]FMISOおよび[18F]FDGの提供に対する香港大学の分子イメージングおよび医療用サイクロトロンセンター(MIMCC)の支援にも感謝します。
Materials
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
References
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