Observation du photocomportement chez Chlamydomonas reinhardtii
Summary
La plupart des organismes photoautotrophes nageant présentent des changements de comportement photo-induits (photocomportement). Le présent protocole observe ledit photocomportement chez l’organisme modèle Chlamydomonas reinhardtii.
Abstract
Pour la survie des micro-organismes phototrophes mobiles, il est crucial d’être dans de bonnes conditions de lumière. Par conséquent, ils montrent des comportements photo-induits (ou photocomportement) et modifient leur direction de mouvement en réponse à la lumière. Les photocomportements typiques comprennent la réponse photochoc (ou photophobe) et la phototaxie. Le photochoc est une réponse à un changement soudain de l’intensité lumineuse (p. ex., l’éclairage du flash), dans lequel les organismes cessent de bouger ou reculent transitoirement. Pendant la phototaxie, les organismes se déplacent vers la source lumineuse ou dans la direction opposée (phototaxie positive ou négative, respectivement). L’algue verte unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii est un excellent organisme pour étudier le photocomportement car elle change rapidement son schéma de nage en modulant le battement des cils (alias flagelles) après photoréception. Ici, diverses méthodes simples sont montrées pour observer les photocomportements chez C. reinhardtii. La recherche sur les photocomportements de C. reinhardtii a conduit à la découverte de mécanismes de régulation communs entre les cils eucaryotes et les channelrhodopsines, ce qui pourrait contribuer à une meilleure compréhension des ciliopathies et au développement de nouvelles méthodes optogénétiques.
Introduction
La lumière est une source d’énergie indispensable pour les organismes photosynthétiques, mais trop de lumière peut causer des dommages photo-oxydatifs. Ainsi, les organismes phototrophes doivent survivre sous une lumière d’intensité modérée, où ils peuvent photosynthétiser mais ne pas subir de dommages photo-oxydatifs1. Chez les plantes terrestres, les chloroplastes ne peuvent pas sortir de la feuille et montrer des mouvements photographiques dans la cellule; les chloroplastes se déplacent vers la périphérie de la cellule sous haute lumière et la surface de la cellule sous faible luminosité2, tandis que de nombreuses algues mobiles présentent des photocomportements qui leur permettent de trouver des conditions de lumière appropriées pour la photosynthèse et, ainsi, facilitent leur survie3.
Chlamydomonas reinhardtii est une algue verte unicellulaire considérée comme un organisme modèle dans des domaines de recherche tels que les cils (alias flagelles), la photosynthèse et le photocomportement. C. reinhardtii se présente avec une tache oculaire et deux cils par cellule, utilisés respectivement pour la photoréception et la natation. La tache oculaire a deux composants: les channelrhodopsines (ChR), les canaux ioniques à barrière lumineuse dans la membrane plasmique et les couches de granules riches en caroténoïdes situées juste derrière les ChR. La tache oculaire agit comme un récepteur de lumière directionnelle puisque les couches de granules riches en caroténoïdes fonctionnent comme un réflecteur de lumière 4,5.
Les ChR ont d’abord été identifiés comme des photorécepteurs provoquant des photocomportements chez C. reinhardtii 6,7,8,9. Bien que deux isoformes, ChR1 et ChR2, se trouvent dans la tache oculaire, des expériences de knock-down ont montré que ChR1 est le photorécepteur principal pour les photocomportements10. Malgré cela, ChR2 a reçu plus d’attention et a joué un rôle central dans le développement de l’optogénétique, une technique permettant de contrôler l’excitation cellulaire par la lumière11. Par conséquent, l’étude des mécanismes de régulation régissant les photocomportements chez C. reinhardtii permettra de mieux comprendre la fonction ChR et d’améliorer l’optogénétique.
Après photoréception, les cellules de C. reinhardtii présentent deux types de photocomportements : la phototaxie et la réponse au photochoc12. La phototaxie est le comportement des cellules nageant dans la direction de la source lumineuse ou dans la direction opposée, appelée phototaxie positive ou négative, respectivement. La réponse au choc photochoc est un comportement que les cellules montrent après avoir détecté un changement soudain de l’intensité lumineuse, par exemple lorsqu’elles sont éclairées par un flash. Les cellules cessent de nager ou nagent vers l’arrière (c.-à-d. nager avec le corps cellulaire vers l’avant) pendant une courte période, généralement <1 s.
Les mouvements ciliaires chez C. reinhardtii sont impliqués dans ses photocomportements. Deux cils battent généralement comme la nage de brasse d’un humain, et cela est modulé pour les photocomportements. Pour la phototaxie, les forces générées par les deux cils sont déséquilibrées par la modulation de la fréquence de battement et l’amplitude de la forme d’onde de chaque cilium13. Le cil le plus proche de la tache oculaire est appelé cis cilium, et l’autre est appelé transcilium. Ces deux cils diffèrent sur différents points. Par exemple, la fréquence de battement ciliaire du transcilium in vitro est de 30% à 40% plus élevée14. De plus, leur sensibilité au Ca2+ est différente. La réactivation des modèles cellulaires démembranés15 a montré que le cis cilium bat plus fortement que le transcilium pour Ca2+ <1 x 10−8 M, tandis que l’inverse est vrai pour Ca2+ >1 x 10−7 M. Cette asymétrie dans la sensibilité au Ca2+ est peut-être importante pour les virages phototaxiques puisque les mutants dépourvus de cette asymétrie ne présentent pas de phototaxie normale16,17. Inversement, la conversion de la forme d’onde est nécessaire pour les photochocs. La forme d’onde ciliaire se transforme de la forme d’onde asymétrique en nage vers l’avant à la forme d’onde symétrique en nage arrière. Cette conversion de forme d’onde est également régulée par Ca2+, à un seuil de 1 x 10−4 M18,19. Étant donné que les défauts de régulation des mouvements ciliaires provoquent une dyskinésie ciliaire primaire chez l’homme, l’étude des photocomportements chez C. reinhardtii pourrait aider à mieux comprendre ces maladies et les développements thérapeutiques20.
Ici, quatre méthodes simples pour observer les photocomportements chez C. reinhardtii sont démontrées. Premièrement, un test de phototaxie utilisant des boîtes de Petri est montré, et deuxièmement, un test de phototaxie contre des gouttelettes de suspension cellulaire. Le phénomène observé dans les deux cas n’est pas strictement phototaxis mais photoaccumulation, où les cellules ont tendance à s’accumuler près du côté de la source lumineuse ou du côté opposé. Chez C. reinhardtii, l’accumulation de photos est principalement causée par la phototaxie d’une manière qui peut être utilisée comme approximation de la phototaxie. Troisièmement, un test plus rigoureux pour la phototaxie au microscope est montré, et le dernier est un test de photochoc sous un microscope.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole actuel est facile et ne prend pas beaucoup de temps. Si un mutant de C. reinhardtii est suspecté de présenter des défauts de photoréception ou de mouvement ciliaire, cette méthode pourrait servir d’analyse phénotypique primaire.
Cependant, certaines étapes critiques existent. L’une consiste à utiliser des cellules dans l’expérience dans la phase de croissance du début au milieu du logarithme. Après avoir cultivé pendant de longues périodes, les cellules…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par des subventions de la Société japonaise pour la promotion de la science KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) à NU (19K23758, 21K06295), TH (16H06556) et KW (19H03242, 20K21420, 21H00420), de la Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) à KW, et de la Dynamic Alliance for Open Innovation Bridging Human, Environment and Materials (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) à NU, TH et KW.
Materials
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| 5 mm Cannonball green LED | Optosupply | OSPG5161P | |
| 50 mL conical tube | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| AC adaptor for the light box | ATTO | 2196161 | |
| Auto cell counter | DeNovix | CellDrop BF | |
| CaCl2 | Nakalai tesque | 06731-05 | |
| Camera flash | NEWWER | TT560 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strains CC-124 and CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| C-mout CCD camera | Wraymer | 1129HMN1/3 | |
| Desktop darkroom | Scientex | B-S8 | |
| Digital still camera | SONY | RX100II | |
| EGTA | Dojindo | G002 | |
| Fiji | https://fiji.sc/ | ||
| Green LED plate | CCS | ISLM-150X150-GG | |
| HCl | Fujifilm WAKO | 080-01066 | |
| HEPES | Dojindo | GB70 | |
| KCl | Nakalai tesque | 238514-75 | |
| Lightbox (Flat viewer) | ATTO | 2196160 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Petri dish (φ3.5 cm) | IWAKI | 1000-035 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Power supply for the green LED plate | CCS | ISC-201-2 | |
| Red filter | Shibuya Optical | S-RG630 |
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