Beobachtung des Photoverhaltens bei Chlamydomonas reinhardtii
Summary
Die meisten schwimmenden photoautotrophen Organismen zeigen photoinduzierte Verhaltensänderungen (Photobehavior). Das vorliegende Protokoll beobachtet das besagte Photoverhalten im Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii.
Abstract
Für das Überleben der beweglichen phototrophen Mikroorganismen ist es entscheidend, unter den richtigen Lichtbedingungen zu stehen. Folglich zeigen sie photoinduziertes Verhalten (oder Fotoverhalten) und ändern ihre Bewegungsrichtung als Reaktion auf Licht. Typische Photoverhaltensweisen sind Photoshock (oder photophobe) Reaktion und Phototaxis. Photoschock ist eine Reaktion auf eine plötzliche Änderung der Lichtintensität (z. B. Blitzbeleuchtung), bei der Organismen vorübergehend aufhören, sich zu bewegen oder sich rückwärts zu bewegen. Während der Phototaxis bewegen sich Organismen in Richtung der Lichtquelle oder in die entgegengesetzte Richtung (positive bzw. negative Phototaxis genannt). Die einzellige Grünalge Chlamydomonas reinhardtii ist ein ausgezeichneter Organismus, um das Photoverhalten zu untersuchen, da sie ihr Schwimmmuster schnell ändert, indem sie das Schlagen von Flimmerchen (auch bekannt als Flagellen) nach der Photorezeption moduliert. Hier werden verschiedene einfache Methoden zur Beobachtung des Photoverhaltens bei C. reinhardtii gezeigt. Die Erforschung des Photoverhaltens von C. reinhardtii hat zur Entdeckung gemeinsamer Regulationsmechanismen zwischen eukaryotischen Zilien und Kanalrhodopsinen geführt, die zu einem besseren Verständnis von Ziliopathien und zur Entwicklung neuer optogenetischer Methoden beitragen können.
Introduction
Licht ist eine unverzichtbare Energiequelle für photosynthetische Organismen, aber zu viel Licht kann photooxidative Schäden verursachen. Daher müssen phototrophe Organismen unter Licht mittlerer Intensität überleben, wo sie Photosynthese betreiben können, aber keinen photooxidativen Schaden erleiden1. Bei Landpflanzen können sich Chloroplasten nicht aus dem Blatt bewegen und zeigen Fotobewegungen in der Zelle; Chloroplasten bewegen sich unter hohem Licht an die Peripherie der Zelle und bei schwachem Licht an die Zelloberfläche2, während viele bewegliche Algen Photoverhalten zeigen, das es ihnen ermöglicht, die richtigen Lichtbedingungen für die Photosynthese zu finden und so ihr Überleben zu erleichtern3.
Chlamydomonas reinhardtii ist eine einzellige Grünalge, die als Modellorganismus in Forschungsbereichen wie Zilien (auch bekannt als Flagellen), Photosynthese und Photoverhalten gilt. C. reinhardtii präsentiert sich mit einem Augenfleck und zwei Zilien pro Zelle, die für den Fotoempfang bzw. das Schwimmen verwendet werden. Der Augenfleck besteht aus zwei Komponenten: Kanalrhodopsinen (ChRs), lichtgesteuerten Ionenkanälen in der Plasmamembran und den Carotinoid-reichen Granulatschichten, die sich direkt hinter den ChRs befinden. Der Augenfleck fungiert als gerichteter Lichtrezeptor, da die Carotinoid-reichen Granulatschichten als Lichtreflektorfungieren 4,5.
ChRs wurden ursprünglich als Photorezeptoren identifiziert, die Photoverhalten in C. reinhardtii 6,7,8,9 verursachen. Obwohl zwei Isoformen, ChR1 und ChR2, im Augenfleck gefunden werden, zeigten Knock-Down-Experimente, dass ChR1 der primäre Photorezeptor für Photobehaviors10 ist. Trotzdem hat ChR2 mehr Aufmerksamkeit erhalten und spielte eine zentrale Rolle bei der Entwicklung der Optogenetik, einer Technik zur Kontrolle der Zellanregung durch Licht11. Daher wird die Untersuchung der regulatorischen Mechanismen, die das Photoverhalten bei C. reinhardtii steuern, das Verständnis der ChR-Funktion fördern und die Optogenetik verbessern.
Nach der Photorezeption zeigen C. reinhardtii-Zellen zwei Arten von Photoverhalten: Phototaxis und Photoschockantwort12. Phototaxis ist das Verhalten von Zellen, die in Richtung der Lichtquelle oder in die entgegengesetzte Richtung schwimmen, was als positive bzw. negative Phototaxis bezeichnet wird. Die Photoschockreaktion ist ein Verhalten, das Zellen zeigen, nachdem sie eine plötzliche Änderung der Lichtintensität wahrgenommen haben, z. B. wenn sie von einem Blitz beleuchtet werden. Zellen hören für kurze Zeit auf zu schwimmen oder schwimmen rückwärts (d.h. mit dem Zellkörper nach vorne schwimmen), typischerweise <1 s.
Ziliarbewegungen bei C. reinhardtii sind an seinem Photoverhalten beteiligt. Zwei Zilien schlagen normalerweise wie das Brustschwimmen eines Menschen, und dies wird für Photobehaviors moduliert. Bei Phototaxis sind die von den beiden Zilien erzeugten Kräfte durch die Modulation der Schlagfrequenz und der Wellenformamplitude jedesZiliums 13 ausgeglichen. Das Zilium, das dem Augenfleck am nächsten ist, heißt cis-cilium und das andere wird trans cilium genannt. Diese beiden Zilien unterscheiden sich in verschiedenen Punkten. Zum Beispiel ist die Ziliarschlagfrequenz von Transcilium in vitro 30% -40% höher14. Darüber hinaus ist ihre Ca2 + –Empfindlichkeit unterschiedlich. Die Reaktivierung demembranierter Zellmodelle15 zeigte, dass das cis-Zilium für Ca 2+ <1 x 10−8 M stärker schlägt als das trans cilium, während das Gegenteil für Ca2+ >1 x 10−7 M gilt. Diese Asymmetrie in Ca2+ Empfindlichkeit ist möglicherweise wichtig für phototaktische Drehungen, da Mutanten, denen diese Asymmetrie fehlt, keine normalen Phototaxis16,17 aufweisen. Umgekehrt ist die Wellenformkonvertierung für den Fotoschock notwendig. Die Ziliarwellenform wandelt sich von der asymmetrischen Wellenform im Vorwärtsschwimmen in die symmetrische Wellenform im Rückwärtsschwimmen um. Diese Wellenformkonvertierung wird auch durch Ca2+ reguliert, bei einem Schwellenwert von 1 x 10−4 M18,19. Da Defekte bei der Regulierung der Ziliarbewegungen beim Menschen eine primäre ziliäre Dyskinesie verursachen, könnte die Untersuchung des Photoverhaltens bei C. reinhardtii zu einem besseren Verständnis dieser Krankheiten und therapeutischen Entwicklungenbeitragen 20.
Hierin werden vier einfache Methoden zur Beobachtung des Photoverhaltens bei C. reinhardtii demonstriert. Erstens wird ein Phototaxis-Assay mit Petrischalen und zweitens ein Phototaxis-Assay gegen Zellsuspensionströpfchen gezeigt. Das in beiden Fällen beobachtete Phänomen ist nicht ausschließlich Phototaxis, sondern Photoakkumulation, bei der sich die Zellen in der Nähe der Lichtquellenseite oder der gegenüberliegenden Seite ansammeln. Bei C. reinhardtii wird die Photoakkumulation hauptsächlich durch Phototaxis in einer Weise verursacht, die als Annäherung an Phototaxis verwendet werden kann. Drittens wird ein strengerer Assay für Phototaxis unter einem Mikroskop gezeigt, und zuletzt ist ein Photoschock-Assay unter einem Mikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorliegende Protokoll ist einfach und nicht zeitaufwendig. Wenn bei einer C. reinhardtii-Mutante der Verdacht besteht, dass sie Defekte in der Photorezeption oder Ziliarbewegung aufweist, könnte diese Methode als primäre phänotypische Analyse dienen.
Es gibt jedoch einige kritische Schritte. Eine besteht darin, Zellen im Experiment in der frühen bis mittleren Log-Wachstumsphase zu verwenden. Nach längerer Kultivierung werden die Zellen weniger beweglich, lichtempfindlich und …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch Zuschüsse der Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) an NU (19K23758, 21K06295), TH (16H06556) und KW (19H03242, 20K21420, 21H00420), von der Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) an KW und von der Dynamic Alliance for Open Innovation Bridging Human, Environment and Materials (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) an NU, TH und KW unterstützt.
Materials
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| 5 mm Cannonball green LED | Optosupply | OSPG5161P | |
| 50 mL conical tube | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| AC adaptor for the light box | ATTO | 2196161 | |
| Auto cell counter | DeNovix | CellDrop BF | |
| CaCl2 | Nakalai tesque | 06731-05 | |
| Camera flash | NEWWER | TT560 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strains CC-124 and CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| C-mout CCD camera | Wraymer | 1129HMN1/3 | |
| Desktop darkroom | Scientex | B-S8 | |
| Digital still camera | SONY | RX100II | |
| EGTA | Dojindo | G002 | |
| Fiji | https://fiji.sc/ | ||
| Green LED plate | CCS | ISLM-150X150-GG | |
| HCl | Fujifilm WAKO | 080-01066 | |
| HEPES | Dojindo | GB70 | |
| KCl | Nakalai tesque | 238514-75 | |
| Lightbox (Flat viewer) | ATTO | 2196160 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Petri dish (φ3.5 cm) | IWAKI | 1000-035 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Power supply for the green LED plate | CCS | ISC-201-2 | |
| Red filter | Shibuya Optical | S-RG630 |
References
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