Een fotodynamische benadering om de functie van intracellulaire vesikelruptuur te bestuderen
Summary
AlPcS2a-gemedieerde chromofoor-geassisteerde laserinactivatie (CALI) is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van spatiotemporale schade van intracellulaire blaasjes (IV’s) in levende cellen.
Abstract
Intracellulaire blaasjes (IV’s) worden gevormd door endocytose van blaasjes in cytoplasma. IV-formatie is betrokken bij het activeren van verschillende signaalroutes door permeabilisatie van IV-membranen en de vorming van endosomen en lysosomen. Een methode genaamd chromofoor-geassisteerde laserinactivatie (CALI) wordt toegepast om de vorming van IV’s en de materialen bij het beheersen van IV-regulatie te bestuderen. CALI is een op beeldvorming gebaseerde fotodynamische methodologie om de signaalroute geïnduceerd door membraanpermeabilisatie te bestuderen. De methode maakt het mogelijk om spatiotemporale manipulatie van het geselecteerde organel in een cel te permeabiliseren. De CALI-methode is toegepast om specifieke moleculen te observeren en te monitoren door de permeabilisatie van endosomen en lysosomen. Van de membraanruptuur van IV’s is bekend dat het selectief glycaanbindende eiwitten rekrutert, zoals galectine-3. Hier beschrijft het protocol de inductie van IV-breuk door AlPcS2a en het gebruik van galectine-3 als een marker om aangetaste lysosomen te labelen, wat nuttig is bij het bestuderen van de stroomafwaartse effecten van IV-membraanruptuur en hun stroomafwaartse effecten onder verschillende situaties.
Introduction
Endosomen, een soort intracellulair blaasje (IV), worden gevormd door endocytose en rijpen vervolgens tot lysosomen. Verschillende intracellulaire signaalroutes zijn betrokken bij de vorming van IV’s; bovendien kunnen verschillende intrinsieke en extrinsieke stimuli IV’s beschadigen (pathogenen kunnen bijvoorbeeld tijdens infectie uit het begrensde membraan ontsnappen en cytoplasma1 binnendringen). Dit gaat meestal gepaard met het scheuren van endocytotische blaasjes2. Daarom kunnen de technieken voor het richten en beschadigen van IV’s worden gebruikt in gerelateerde studies3.
Fotodynamische therapie (PDT) is een lichtafhankelijke therapie om ziekten te bestrijden door tumoren of ziekteverwekkers te doden4. In PDT worden gerichte cellen gelabeld met niet-toxische chromoforen, fotosensitizers genaamd, die lokaal kunnen worden geactiveerd door lichtverlichting 5,6. Fotosensitizers absorberen energie van licht en transformeren in een aangeslagen singlettoestand, wat leidt tot de langlevende aangeslagen triplettoestand. Fotosensitizers van de triplettoestand kunnen elektronen- of energieoverdracht ondergaan en reactieve zuurstofsoorten (ROS) vormen in aanwezigheid van zuurstof, en kunnen gelabelde cellen binnen het verlichtingsgebiedruimtelijk vernietigen 7. Het gevolg varieert afhankelijk van de kracht van licht8. Door de concentratie van fotosensitizers en de intensiteit van lichtverlichting te regelen, kunnen gerichte biomoleculen selectief worden geïnactiveerd zonder cellyse, aangeduid als chromofoorondersteunde lichtinactivatie (CALI)9. Met de aanzienlijke ontwikkeling van fotosensitizers die selectief verschillende subcellulaire doelen kunnen labelen, is CALI een waardevol hulpmiddel geworden om lichtgemedieerde inactivatie van biomoleculen voor kleine biomoleculen zoals nucleotiden en eiwitten, evenals organellen zoals mitochondriën en endo-lysosomen 3,10,11,12,13 te beheersen.
In vergelijking met CALI worden chemische of fysische methoden ook gebruikt om membranen aan te tasten, zoals bacteriële toxine 14,15 en Leu-Leu-OMe16-behandeling voor lysosomale schade. Deze methoden vertonen echter bulkbeschadiging van IV’s in cellen. Robuuste fotosensitizers (d.w.z. Al(III) ftalocyaninechloridedisulfonzuur (AlPcS2a)) worden gebruikt in CALI; AlPcS2a, gericht op de lysosomen door middel van endocytose, wordt gebruikt om endosomen of lysosomen te scheuren in een gecontroleerd gebied17. AlPcS2a is een celmembraan-ondoordringbare ftalocyanine-gebaseerde chromofoor die bindt aan lipide op plasmamembraan en wordt geïnternaliseerd door endocytose en uiteindelijk accumuleert in het lysosoom via de endocytische route18. Het absorbeert licht in een nabij-infrarood spectraal gebied en genereert singlet zuurstof, een belangrijke ROS gegenereerd door geëxciteerde AlPcS2a18. Singlet zuurstof die snel vervalt, beperkt de diffusie- en reactieafstand binnen een klein gebied in cellen (ongeveer 10-20 nm)19. Door de duur van AlPcS2a-incubatie en lichtverlichting aan te passen, is spatiotemporele controle van de schade aan IV’s binnen een subcellulair gebied mogelijk. CALI wordt daarom een krachtig instrument voor het onderzoeken van de gevolgen van IV-schade en de vorming en regulering van IV’s.
In deze studie wordt een specifiek protocol van CALI met AlPcS2a als fotosensitizer behandeld. Dit protocol kan worden toegepast op verschillende soorten IV’s, waaronder endosomen en lysosomen, en worden gebruikt om de follow-upreacties na membraanruptuur te onderzoeken. HeLa-cellen die fluorofoor-geconjugeerd galectine-316,20 tot expressie brengen, onthuld na lysosoomruptuur, worden gebruikt om dit protocol aan te tonen.
Protocol
Representative Results
Discussion
AlPcS2a bindt zich aan het plasmamembraan, wordt vervolgens geïnternaliseerd door endocytose en hoopt zich uiteindelijk op in lysosomen. AlPcS2a kan dus worden gelokaliseerd in de subcellulaire compartimenten door de incubatietijd aan te passen. Een beperking van deze methodologie is dat alleen een subpopulatie van IV’s kan worden gelabeld door AlPcS2a door endocytose omdat er veel andere membraanbronnen van IV’s zijn, zoals ER- en Golgi-apparaten. Bovendien zou de selectieve etiketterin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen de Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS bedanken voor onderzoeksondersteuning. De kernfaciliteit wordt gefinancierd door de Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213). De auteurs bedanken de Common Equipment Core Facility van het Institute of Biomedical Sciences (IBMS), Academia Sinica (AS) voor het assisteren bij de beeldacquisitie.
Materials
| Reagent | |||
| Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
| Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
| Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
| Cell line | |||
| HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
| Equipments | |||
| 0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
| Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |
References
- Cossart, P., Helenius, A. Endocytosis of viruses and bacteria. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (8), 016972 (2014).
- Daussy, C. F., Wodrich, H. 34;Repair me if you can": membrane damage, response, and control from the viral perspective. Cells. 9 (9), 2042 (2020).
- Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
- Sharma, S. K., et al. Photodynamic therapy for cancer and for infections: what is the difference. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 691-705 (2012).
- Kübler, A. C. Photodynamic therapy. Medical Laser Application. 20 (1), 37-45 (2005).
- De Rosa, F. S., Bentley, M. V. Photodynamic therapy of skin cancers: sensitizers, clinical studies and future directives. Pharmaceutical Research. 17 (12), 1447-1455 (2000).
- Hamblin, M. R. New photosensitizers for photodynamic therapy. Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).
- Lavie, G., et al. A photodynamic pathway to apoptosis and necrosis induced by dimethyl tetrahydroxyhelianthrone and hypericin in leukaemic cells: possible relevance to photodynamic therapy. British Journal of Cancer. 79 (3-4), 423-432 (1999).
- Jay, D. G. Selective destruction of protein function by chromophore-assisted laser inactivation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85 (15), 5454-5458 (1988).
- Grate, D., Wilson, C. Laser-mediated, site-specific inactivation of RNA transcripts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (11), 6131-6136 (1999).
- Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
- Hsieh, C. W., Yang, W. Y. Triggering mitophagy with photosensitizers. Methods in Molecular Biology. 1880, 611-619 (2019).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of Parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
- Molinari, M., et al. Vacuoles induced by Helicobacter pylori toxin contain both late endosomal and lysosomal markers. Journal of Biological Chemistry. 272 (40), 25339-25344 (1997).
- Prince, L. R., et al. Subversion of a lysosomal pathway regulating neutrophil apoptosis by a major bacterial toxin, pyocyanin. Journal of Immunology. 180 (5), 3502-3511 (2008).
- Aits, S., et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 11 (8), 1408-1424 (2015).
- Prasmickaite, L., Hogset, A., Berg, K. Evaluation of different photosensitizers for use in photochemical gene transfection. Photochemistry and Photobiology. 73 (4), 388-395 (2001).
- Berg, K., et al. Photochemical internalization: a novel technology for delivery of macromolecules into cytosol. Cancer Research. 59 (6), 1180-1183 (1999).
- Moan, J., Berg, K. The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the lifetime of singlet oxygen. Photochemistry and Photobiology. 53 (4), 549-553 (1991).
- Thurston, T. L., Wandel, M. P., von Muhlinen, N., Foeglein, A., Randow, F. Galectin 8 targets damaged vesicles for autophagy to defend cells against bacterial invasion. Nature. 482 (7385), 414-418 (2012).
- Repnik, U., et al. L-leucyl-L-leucine methyl ester does not release cysteine cathepsins to the cytosol but inactivates them in transiently permeabilized lysosomes. Journal of Cell Science. 130 (18), 3124-3140 (2017).
- Griffiths, G., Hoflack, B., Simons, K., Mellman, I., Kornfeld, S. The mannose 6-phosphate receptor and the biogenesis of lysosomes. Cell. 52 (3), 329-341 (1988).
- Jia, J., et al. Galectin-3 Coordinates a cellular system for lysosomal repair and removal. Developmental Cell. 52 (1), 69-87 (2020).
- Chu, Y. P., Hung, Y. H., Chang, H. Y., Yang, W. Y. Assays to monitor lysophagy. Methods in Enzymology. 588, 231-244 (2017).
- Nguyen, L., Madsen, S. J., Berg, K., Hirschberg, H. An improved in vitro photochemical internalization protocol for 3D spheroid cultures. Lasers in Medical Science. 36 (8), 1567-1571 (2021).
- Daugelaviciene, N., et al. Lysosome-targeted photodynamic treatment induces primary keratinocyte differentiation. Journal of Photochemistry and Photobiology. B, Biology. 218, 112183 (2021).
- Hong, M. H., et al. Intracellular galectins control cellular responses commensurate with cell surface carbohydrate composition. Glycobiology. 30 (1), 49-57 (2019).
