Summary

세포내 소포 파열의 기능을 연구하기 위한 광역학적 접근

Published: March 17, 2023
doi:

Summary

AlPcS2a 매개 발색단 보조 레이저 비활성화(CALI)는 살아있는 세포에서 세포내 소포(IV)의 시공간 손상을 연구하기 위한 강력한 도구입니다.

Abstract

세포내 소포(IV)는 소포가 세포질로 세포내로 세포내이입되는 것을 통해 형성됩니다. IV 형성은 IV 막의 투과화와 엔도솜 및 리소좀의 형성을 통해 다양한 신호 경로를 활성화하는 데 관여합니다. 발색단 보조 레이저 비활성화(CALI)라는 방법이 IV 형성과 IV 조절을 제어하는 재료를 연구하는 데 적용됩니다. CALI는 막 투과화에 의해 유도된 신호 전달 경로를 연구하기 위한 이미징 기반 광역학 방법론입니다. 이 방법을 사용하면 선택된 세포 기관의 시공간 조작이 세포에서 투과될 수 있습니다. CALI 방법은 엔도솜과 리소좀의 투과를 통해 특정 분자를 관찰하고 모니터링하는 데 적용되었습니다. IV의 막 파열은 갈렉틴-3과 같은 글리칸 결합 단백질을 선택적으로 모집하는 것으로 알려져 있습니다. 여기에서 프로토콜은 AlPcS2a 에 의한 IV 파열 유도와 손상된 리소좀을 표지하기 위한 마커로 갈렉틴-3의 사용을 설명하며, 이는 IV 막 파열의 다운스트림 효과와 다양한 상황에서 다운스트림 효과를 연구하는 데 유용합니다.

Introduction

세포내 소포(IV)의 일종인 엔도솜은 엔도사이토시스에 의해 형성되고 리소좀으로 성숙합니다. 다양한 세포 내 신호 경로가 IV의 형성에 관여합니다. 또한, 상이한 내인성 및 외인성 자극이 IV를 손상시킬 수 있습니다(예: 병원체는 감염 중에 경계막에서 빠져나와 세포질1로 들어갈 수 있음). 이것은 일반적으로 endocytotic vesicle의 파열을 동반합니다2. 따라서 IV를 표적화하고 손상시키는 기술은 관련 연구에서 사용될 수 있다3.

광역학 치료(Photodynamic therapy, PDT)는 종양이나 병원체를 죽임으로써 질병을 퇴치하기 위한 빛 의존 요법이다4. PDT에서, 표적 세포는 광감작제라고 불리는 비독성 발색단으로 표지되며, 이는 광 조명 5,6에 의해 국소적으로 활성화될 수 있다. 감광제는 빛에서 에너지를 흡수하여 여기된 일중항 상태로 변환되어 수명이 긴 여기된 삼중항 상태로 이어집니다. 삼중항 상태의 광감작제는 전자 또는 에너지 전달을 겪을 수 있고, 산소의 존재 하에서 반응성 산소종(ROS)을 형성할 수 있으며, 조명 영역(7) 내에서 표지된 세포를 공간적으로 파괴할 수 있다. 결과는 빛의 힘에 따라 달라진다8. 감광제의 농도와 조명 강도를 제어함으로써 표적 생체 분자를 세포 용해 없이 선택적으로 비활성화할 수 있으며, 이를 발색단 보조 광 비활성화(CALI)라고 합니다9. 다양한 세포 내 표적을 선택적으로 표지할 수 있는 광감작제가 크게 개발됨에 따라 CALI는 미토콘드리아 엔도-리소좀과 같은 세포 기관뿐만 아니라 뉴클레오티드 및 단백질과 같은 작은 생체 분자에 대한 생체 분자의 빛 매개 불활성화를 제어하는 귀중한 도구가 되었습니다 3,10,11,12,13.

CALI와 비교하여 화학적 또는 물리적 방법은 박테리아 독소 14,15 및 리소좀 손상에 대한 Leu-Leu-OMe16 치료와 같은 막을 손상시키는 데에도 사용됩니다. 그러나 이러한 방법은 세포 내에서 IV의 대량 손상을 표시합니다. 강력한 감광제(즉, Al(III) 프탈로시아닌 클로라이드 디설폰산(AlPcS2a))가 CALI에 사용됩니다. 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 리소좀을 표적으로 하는AlPcS2a는 제어 영역(17)에서 엔도솜 또는 리소좀을 파열시키는 데 사용된다. AlPcS2a는 세포막 불투과성 프탈로시아닌 기반 발색단으로 원형질막의 지질에 결합하고 엔도사이토시스를 통해 내재화되어 결국 내세포 경로18을 통해 리소좀 내에 축적됩니다. 근적외선 스펙트럼 영역 내에서 빛을 흡수하고 여기된 AlPcS2a18에 의해 생성되는 주요 ROS인 일중항 산소를 생성합니다. 일중항 산소 붕괴는 세포의 작은 영역(약 10-20nm) 내에서 확산 및 반응 거리를 빠르게 제한합니다19. AlPcS2a 배양 기간 및 광 조명을 조정함으로써 세포 내 영역 내에서 IV의 손상에 대한 시공간 제어가 허용됩니다. 따라서 CALI는 IV 손상의 결과와 IV의 형성 및 조절을 조사하는 강력한 도구가 됩니다.

본 연구에서는 AlPcS2a를 광감작제로 사용하는 CALI의 특정 프로토콜을 다룬다. 이 프로토콜은 엔도솜 및 리소좀을 포함한 다양한 유형의 IV에 적용할 수 있으며 막 파열 후 후속 반응을 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 리소좀 파열 후 밝혀진 형광단 접합 갈렉틴-316,20을 발현하는 HeLa 세포는 이 프로토콜을 입증하는 데 사용됩니다.

Protocol

1. AlPcS2a 재고 준비 10mg의 AlPcS2a 를 400μL의 0.1M NaOH에 녹입니다. 용해도를 향상시키기 위해, 용액을 50°C에서 가열하고 와동시킨다. 용액을 4mL의 인산염 완충 식염수(PBS)와 혼합합니다. 그 후, 용액을 0.22 μm 필터로 여과하여 불용성 침전물을 제거하였다. UV-Vis 분광광도계를 통해 용액의 농도를 측정합니다. 672 nm에서 AlPcS2a의 흡광 계수는 4 x …

Representative Results

엔도솜과 리소좀을 포함한 IV의 AlPcS2a 유발 손상을 나타내는 개략도가 표시되었습니다(그림 1). 시판되는 마커는AlPcS2a 염색 조건을 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, AlPcS2a 반점 및 녹색 형광 염료22 colocalization (그림 2). 형광단 표지된 갈렉틴-3은 IV 손상을 모니터…

Discussion

AlPcS2a는 원형질막에 결합한 다음 엔도사이토시스에 의해 내재화되어 결국 리소좀에 축적됩니다. 따라서 AlPcS2a는 배양 기간을 조정하여 세포하 구획에 국한시킬 수 있습니다. 이 방법론의 한계는 ER 및 골지체와 같은 IV의 다른 막 공급원이 많기 때문에 엔도사이토시스를 통해 IV의 하위 집단만 AlPcS2a에 의해 표지될 수 있다는 것입니다. 또한, AlPcS2a를 초기 또는 후기…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 연구 지원을 위해 Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS에 감사드립니다. 핵심 시설은 Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213)의 자금 지원을 받습니다. 저자는 이미지 획득을 지원해 준 IBMS(Institute of Biomedical Sciences), AS(Academia Sinica)의 Common Equipment Core Facility에 감사드립니다.

Materials

Reagent
Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) Frontier Scientific P40632
Culture dish ibidi 812128-200
Culture Medium DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin
DMEM Gibco 11965092
FBS Thermo Fisher Scientific A4736301
Gal3-GFP plasmid addgene
Lipofectamine 3000 kit Thermo Fisher Scientific L3000008
LysoTracker Green DND-26 Thermo Fisher Scientific L7526 green fluorescent dye
Multiwall plate perkinelmer PK-6005550
NaOH Thermo Fisher Scientific Q15895
OptiMEM Thermo Fisher Scientific 31985070
Penicillin-streptomycin Gibco 15140163
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Gibco 21600-069 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4
Cell line
HeLa Cell Line ATCC CCL-2 The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually.
Equipments
0.22 µm Filter Merck SLGV013SL
Collimated LED Light  (660nm) Thorlabs M660L3-C1 and DC2100 Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a.
Confocal microscopy Carl Zeiss LSM 780 An incubation system is required for long-term imaging.
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific
Red LED light Tholabs M660L4-C1

References

  1. Cossart, P., Helenius, A. Endocytosis of viruses and bacteria. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (8), 016972 (2014).
  2. Daussy, C. F., Wodrich, H. 34;Repair me if you can": membrane damage, response, and control from the viral perspective. Cells. 9 (9), 2042 (2020).
  3. Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
  4. Sharma, S. K., et al. Photodynamic therapy for cancer and for infections: what is the difference. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 691-705 (2012).
  5. Kübler, A. C. Photodynamic therapy. Medical Laser Application. 20 (1), 37-45 (2005).
  6. De Rosa, F. S., Bentley, M. V. Photodynamic therapy of skin cancers: sensitizers, clinical studies and future directives. Pharmaceutical Research. 17 (12), 1447-1455 (2000).
  7. Hamblin, M. R. New photosensitizers for photodynamic therapy. Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).
  8. Lavie, G., et al. A photodynamic pathway to apoptosis and necrosis induced by dimethyl tetrahydroxyhelianthrone and hypericin in leukaemic cells: possible relevance to photodynamic therapy. British Journal of Cancer. 79 (3-4), 423-432 (1999).
  9. Jay, D. G. Selective destruction of protein function by chromophore-assisted laser inactivation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85 (15), 5454-5458 (1988).
  10. Grate, D., Wilson, C. Laser-mediated, site-specific inactivation of RNA transcripts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (11), 6131-6136 (1999).
  11. Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
  12. Hsieh, C. W., Yang, W. Y. Triggering mitophagy with photosensitizers. Methods in Molecular Biology. 1880, 611-619 (2019).
  13. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of Parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
  14. Molinari, M., et al. Vacuoles induced by Helicobacter pylori toxin contain both late endosomal and lysosomal markers. Journal of Biological Chemistry. 272 (40), 25339-25344 (1997).
  15. Prince, L. R., et al. Subversion of a lysosomal pathway regulating neutrophil apoptosis by a major bacterial toxin, pyocyanin. Journal of Immunology. 180 (5), 3502-3511 (2008).
  16. Aits, S., et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 11 (8), 1408-1424 (2015).
  17. Prasmickaite, L., Hogset, A., Berg, K. Evaluation of different photosensitizers for use in photochemical gene transfection. Photochemistry and Photobiology. 73 (4), 388-395 (2001).
  18. Berg, K., et al. Photochemical internalization: a novel technology for delivery of macromolecules into cytosol. Cancer Research. 59 (6), 1180-1183 (1999).
  19. Moan, J., Berg, K. The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the lifetime of singlet oxygen. Photochemistry and Photobiology. 53 (4), 549-553 (1991).
  20. Thurston, T. L., Wandel, M. P., von Muhlinen, N., Foeglein, A., Randow, F. Galectin 8 targets damaged vesicles for autophagy to defend cells against bacterial invasion. Nature. 482 (7385), 414-418 (2012).
  21. Repnik, U., et al. L-leucyl-L-leucine methyl ester does not release cysteine cathepsins to the cytosol but inactivates them in transiently permeabilized lysosomes. Journal of Cell Science. 130 (18), 3124-3140 (2017).
  22. Griffiths, G., Hoflack, B., Simons, K., Mellman, I., Kornfeld, S. The mannose 6-phosphate receptor and the biogenesis of lysosomes. Cell. 52 (3), 329-341 (1988).
  23. Jia, J., et al. Galectin-3 Coordinates a cellular system for lysosomal repair and removal. Developmental Cell. 52 (1), 69-87 (2020).
  24. Chu, Y. P., Hung, Y. H., Chang, H. Y., Yang, W. Y. Assays to monitor lysophagy. Methods in Enzymology. 588, 231-244 (2017).
  25. Nguyen, L., Madsen, S. J., Berg, K., Hirschberg, H. An improved in vitro photochemical internalization protocol for 3D spheroid cultures. Lasers in Medical Science. 36 (8), 1567-1571 (2021).
  26. Daugelaviciene, N., et al. Lysosome-targeted photodynamic treatment induces primary keratinocyte differentiation. Journal of Photochemistry and Photobiology. B, Biology. 218, 112183 (2021).
  27. Hong, M. H., et al. Intracellular galectins control cellular responses commensurate with cell surface carbohydrate composition. Glycobiology. 30 (1), 49-57 (2019).

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Cite This Article
Hung, Y., Wang, H., Wang, J., Hsu, C., Chen, H. A Photodynamic Approach to Study Function of Intracellular Vesicle Rupture. J. Vis. Exp. (193), e63962, doi:10.3791/63962 (2023).

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