इंट्रासेल्युलर पुटिका टूटना के कार्य का अध्ययन करने के लिए एक फोटोडायनामिक दृष्टिकोण
Summary
एएलपीसीएस2 ए-मध्यस्थता क्रोमोफोर-असिस्टेड लेजर निष्क्रियता (सीएएलआई) जीवित कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर पुटिकाओं (आईवीएस) के स्थानिक क्षति का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।
Abstract
इंट्रासेल्युलर वेसिकल्स (आईवी) साइटोप्लाज्म में पुटिकाओं के एंडोसाइटोसिस के माध्यम से बनते हैं। IV गठन IV झिल्ली के परमेबिलाइजेशन और एंडोसोम और लाइसोसोम के गठन के माध्यम से विभिन्न संकेत मार्गों को सक्रिय करने में शामिल है। आईवी के गठन और आईवी विनियमन को नियंत्रित करने में सामग्री का अध्ययन करने के लिए क्रोमोफोर-असिस्टेड लेजर निष्क्रियता (सीएएलआई) नामक एक विधि लागू की जाती है। सीएएलआई एक इमेजिंग-आधारित फोटोडायनामिक पद्धति है जो झिल्ली परमेबिलाइजेशन द्वारा प्रेरित सिग्नलिंग मार्ग का अध्ययन करती है। विधि चयनित ऑर्गेनेल के स्थानिक हेरफेर को एक सेल में प्रतिरक्षित करने की अनुमति देती है। कैली विधि को एंडोसोम और लाइसोसोम के परमेबिलाइजेशन के माध्यम से विशिष्ट अणुओं का निरीक्षण और निगरानी करने के लिए लागू किया गया है। आईवीएस के झिल्ली टूटने को चुनिंदा ग्लाइकन-बाइंडिंग प्रोटीन, जैसे गैलेक्टिन -3 की भर्ती के लिए जाना जाता है। यहां, प्रोटोकॉल एएलपीएस2 ए द्वारा आईवी टूटने के प्रेरण और बिगड़ा हुआ लाइसोसोम लेबल करने के लिए मार्कर के रूप में गैलेक्टिन -3 के उपयोग का वर्णन करता है, जो आईवी झिल्ली टूटने के डाउनस्ट्रीम प्रभावों और विभिन्न स्थितियों में उनके डाउनस्ट्रीम प्रभावों का अध्ययन करने में उपयोगी है।
Introduction
एंडोसोम, एक प्रकार का इंट्रासेल्युलर पुटिका (IV), एंडोसाइटोसिस द्वारा बनता है और फिर लाइसोसोम में परिपक्व होता है। आईवीएस के गठन में विभिन्न इंट्रासेल्युलर सिग्नल मार्ग शामिल हैं; इसके अतिरिक्त, विभिन्न आंतरिक और बाह्य उत्तेजनाएं आईवीएस को नुकसान पहुंचा सकती हैं (उदाहरण के लिए, रोगजनक संक्रमण के दौरान बंधे हुए झिल्ली से बच सकते हैं और साइटोप्लाज्म1 में प्रवेश कर सकते हैं)। यह आमतौर पर एंडोसाइटिकपुटिकाओं के टूटने के साथ होता है। इसलिए, आईवी को लक्षित करने और नुकसान पहुंचाने की तकनीकों का उपयोग संबंधित अध्ययनों में किया जा सकताहै।
फोटोडायनामिक थेरेपी (पीडीटी) ट्यूमर या रोगजनकों को मारकर बीमारियों का मुकाबलाकरने के लिए एक प्रकाश-निर्भर चिकित्सा है। पीडीटी में, लक्षित कोशिकाओं को गैर विषैले क्रोमोफोर के साथ लेबल किया जाता है, जिसे फोटोसेंसिटाइज़र कहा जाता है, जिसे स्थानीय रूप से प्रकाश रोशनी 5,6 द्वारा सक्रिय किया जा सकता है। फोटोसेंसिटाइज़र प्रकाश से ऊर्जा को अवशोषित करते हैं और एक उत्तेजित एकल अवस्था में बदल जाते हैं, जिससे लंबे समय तक उत्तेजित ट्रिपल अवस्था होती है। ट्रिपल अवस्था के फोटोसेंसिटाइज़र इलेक्ट्रॉन या ऊर्जा हस्तांतरण से गुजर सकते हैं और ऑक्सीजन की उपस्थिति में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का निर्माण कर सकते हैं, और रोशनी क्षेत्र7 के भीतर लेबल कोशिकाओं को स्थानिक रूप से नष्ट कर सकते हैं। परिणाम प्रकाश8 की शक्ति के आधार पर भिन्न होता है। फोटोसेंसिटाइज़र की एकाग्रता और प्रकाश रोशनी की तीव्रता को नियंत्रित करके, लक्षित बायोमोलेक्यूल्स को सेल लाइसिस के बिना चुनिंदा रूप से निष्क्रिय किया जा सकता है, जिसे क्रोमोफोर-असिस्टेड लाइट निष्क्रियता (सीएएलआई) 9 कहा जाता है। फोटोसेंसिटाइज़र के महत्वपूर्ण विकास के साथ जो चुनिंदा रूप से विभिन्न उपकोशिकीय लक्ष्यों को लेबल कर सकते हैं, सीएएलआई छोटे बायोमोलेक्यूल्स जैसे न्यूक्लियोटाइड ्स और प्रोटीन, साथ ही माइटोकॉन्ड्रिया और एंडो-लाइसोसोम जैसे ऑर्गेनेल 3,10,11,12,13 के लिए बायोमोलेक्यूल्स की प्रकाश-मध्यस्थता निष्क्रियता को नियंत्रित करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण बन गया है।
कैली की तुलना में, रासायनिक या भौतिक तरीकों का उपयोग झिल्ली को खराब करने के लिए भी किया जाता है, जैसे कि बैक्टीरियल टॉक्सिन 14,15 और लाइसोसोमल क्षति के लिए ल्यू-ल्यू-ओएमई16 उपचार। हालांकि, ये विधियां कोशिकाओं के भीतर आईवीएस की थोक हानि प्रदर्शित करती हैं। मजबूत फोटोसेंसिटाइज़र (यानी, अल (III) फ्थालोसाइनिन क्लोराइड डाइसल्फोनिक एसिड (एएलपीसीएस2 ए)) सीएएलआई में उपयोग किया जाता है; एएलपीएस2 ए, एंडोसाइटोसिस के माध्यम से लाइसोसोम को लक्षित करते हुए, एक नियंत्रित क्षेत्र17 में एंडोसोम या लाइसोसोम को तोड़ने के लिए उपयोग किया जाता है। एएलपीसीएस2 ए एक कोशिका झिल्ली-अभेद्य फ्थालोसाइनिन-आधारित क्रोमोफोर है जो प्लाज्मा झिल्ली पर लिपिड को बांधता है और एंडोसाइटोसिस के माध्यम से आंतरिक होता है और अंततः एंडोसाइटिक मार्ग18 के माध्यम से लाइसोसोम के भीतर जमा होता है। यह एक निकट-अवरक्त वर्णक्रमीय क्षेत्र के भीतर प्रकाश को अवशोषित करता है और एकल ऑक्सीजन उत्पन्न करता है, जो उत्तेजित एएलपीएस2 ए 18 द्वारा उत्पन्न एक प्रमुख आरओएस है। सिंगलेट ऑक्सीजन क्षय तेजी से कोशिकाओं में एक छोटे से क्षेत्र (लगभग 10-20 एनएम) के भीतर इसके प्रसार और प्रतिक्रिया दूरी को सीमित करता है। एएलपीएस2 ए इनक्यूबेशन और प्रकाश रोशनी की अवधि को समायोजित करके, एक उपकोशिकीय क्षेत्र के भीतर आईवीएस की क्षति के स्थानिक नियंत्रण की अनुमति है। इसलिए सीएएलआई आईवी क्षति के परिणामों की जांच करने और आईवीएस के गठन और विनियमन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन जाता है।
इस अध्ययन में, एक फोटोसेंसिटाइज़र के रूप में AlPCS2a का उपयोग करके CALI के एक विशिष्ट प्रोटोकॉल को संबोधित किया गया है। इस प्रोटोकॉल को एंडोसोम और लाइसोसोम सहित विभिन्न प्रकार के आईवीएस पर लागू किया जा सकता है, और झिल्ली टूटने के बाद अनुवर्ती प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है। लाइसोसोम टूटने के बाद फ्लोरोफोरे-संयुग्मित गैलेक्टिन -316,20 को व्यक्त करने वाली हेला कोशिकाओं का उपयोग इस प्रोटोकॉल को प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एएलपीएस2 ए प्लाज्मा झिल्ली को बांधता है, फिर एंडोसाइटोसिस द्वारा आंतरिक होता है और अंततः लाइसोसोम में जमा होता है। इस प्रकार इनक्यूबेशन अवधि को समायोजित करके एएलपीएस2 ए को उपकोशिकीय डिब्बों म?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक अनुसंधान समर्थन के लिए अकादमिक सिनिका इन्फ्लेमेशन कोर सुविधा, आईबीएमएस को धन्यवाद देना चाहते हैं। कोर सुविधा को अकादमिक सिनिका कोर सुविधा और अभिनव उपकरण परियोजना (एएस-सीएफआई-111-213) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। लेखक छवि अधिग्रहण में सहायता के लिए इंस्टीट्यूट ऑफ बायोमेडिकल साइंसेज (आईबीएमएस), एकेडेमिया सिनिका (एएस) के सामान्य उपकरण कोर सुविधा को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Reagent | |||
| Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
| Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
| Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
| Cell line | |||
| HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
| Equipments | |||
| 0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
| Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |
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