En fotodynamisk tilnærming til å studere funksjonen av intracellulær vesikkelbrudd

Summary

AlPcS_2a-mediert kromoforassistert laserinaktivering (CALI) er et kraftig verktøy for å studere spatiotemporal skade av intracellulære vesikler (IV) i levende celler.

Abstract

Intracellulære vesikler (IV) dannes gjennom endocytose av vesikler til cytoplasma. IV-dannelse er involvert i aktivering av forskjellige signalveier gjennom permeabilisering av IV-membraner og dannelse av endosomer og lysosomer. En metode som kalles kromoforassistert laserinaktivering (CALI) brukes til å studere dannelsen av IV og materialene i å kontrollere IV-regulering. CALI er en bildebasert fotodynamisk metodikk for å studere signalveien indusert av membranpermeabilisering. Metoden tillater spatiotemporal manipulering av den valgte organellen som skal permeabiliseres i en celle. CALI-metoden har blitt brukt til å observere og overvåke spesifikke molekyler gjennom permeabilisering av endosomer og lysosomer. Membranbrudd av IVs er kjent for å selektivt rekruttere glykanbindende proteiner, slik som galektin-3. Her beskriver protokollen induksjon av IV-ruptur av AlPcS_2a og bruk av galektin-3 som markør for å merke nedsatte lysosomer, noe som er nyttig for å studere nedstrømseffektene av IV-membranbrudd og deres nedstrømseffekter under ulike situasjoner.

Introduction

Endosomer, en type intracellulær vesikkel (IV), dannes ved endocytose og modnes deretter til lysosomer. Ulike intracellulære signalveier er involvert i dannelsen av IVer; I tillegg kan forskjellige indre og ytre stimuli skade IVs (f.eks. patogener kan unnslippe fra den begrensede membranen under infeksjon og gå inn i cytoplasma¹). Dette er vanligvis ledsaget av brudd på endocytotiske vesikler². Derfor kan teknikkene for å målrette og skade IVs brukes i relaterte studier³.

Fotodynamisk terapi (PDT) er en lysavhengig terapi for å bekjempe sykdommer ved å drepe svulster eller patogener⁴. I PDT er målrettede celler merket med ikke-giftige kromoforer, kalt fotosensibilisatorer, som kan aktiveres lokalt ved lysbelysning ^5,6. Fotosensibilisatorer absorberer energi fra lys og forvandles til en opphisset singlettilstand, noe som fører til den langlivede eksiterte trillingtilstanden. Fotosensibilisatorer av tripletttilstanden kan gjennomgå elektron- eller energioverføring og danne reaktive oksygenarter (ROS) i nærvær av oksygen, og kan romlig ødelegge merkede celler i belysningsområdet⁷. Konsekvensen varierer avhengig av lysets kraft⁸. Ved å kontrollere konsentrasjonen av fotosensibilisatorer og intensiteten av lysbelysning, kan målrettede biomolekyler selektivt inaktiveres uten cellelyse, betegnet som kromoforassistert lysinaktivering (CALI)⁹. Med den betydelige utviklingen av fotosensibilisatorer som selektivt kan merke forskjellige subcellulære mål, har CALI blitt et verdifullt verktøy for å kontrollere lysmediert inaktivering av biomolekyler for små biomolekyler som nukleotider og proteiner, samt organeller som mitokondrier og endo-lysosomer 3,10,11,12,13.

Sammenlignet med CALI brukes kjemiske eller fysiske metoder også for å svekke membraner, for eksempel bakteriell toksin ^14,15 og Leu-Leu-OMe ^{16-behandling} for lysosomal skade. Imidlertid viser disse metodene bulk svekkelse av IVs i celler. Robuste fotosensibilisatorer (dvs. Al(III)ftalocyaninkloriddisulfonsyre (AlPcS_2a)) brukes i CALI; AlPcS_2a, rettet mot lysosomene gjennom endocytose, brukes til å bryte endosomer eller lysosomer i et kontrollert område¹⁷. AlPcS_2a er en cellemembran-ugjennomtrengelig ftalocyaninbasert kromofor som binder seg til lipid på plasmamembran og internaliseres gjennom endocytose og til slutt akkumuleres i lysosomet gjennom endocytisk vei¹⁸. Den absorberer lys i et nær-infrarødt spektralområde og genererer singlet oksygen, en stor ROS generert av eksitert AlPcS_2a¹⁸. Singlet oksygenhenfall begrenser raskt diffusjons- og reaksjonsavstanden innenfor et lite område i celler (ca. 10-20 nm)¹⁹. Ved å justere_varigheten av AlPcS 2a-inkubasjon og lysbelysning, er spatiotemporal kontroll av skaden av IV innenfor et subcellulært område tillatt. CALI blir derfor et kraftig verktøy for å undersøke konsekvensene av IV-skade, og dannelse og regulering av IV.

I denne studien adresseres en spesifikk protokoll for CALI ved bruk av AlPcS_2a som fotosensibilisator. Denne protokollen kan brukes på ulike typer IV, inkludert endosomer og lysosomer, og brukes til å undersøke oppfølgingsresponsene etter membranbrudd. HeLa-celler som uttrykker fluoroforkonjugert galektin-3^16,20 avslørt etter lysosomruptur^, brukes til å demonstrere denne protokollen.

Protocol

1. AlPcS2a lagerforberedelse Løs opp 10 mg AlPcS2a i 400 μL med 0,1 M NaOH. For å forbedre løseligheten, varm opp oppløsningen ved 50 °C og virvel. Bland oppløsningen med 4 ml fosfatbufret saltvann (PBS). Filtrer deretter løsningen med et 0,22 μm filter for å fjerne de uoppløselige utfellingene. Mål konsentrasjonen av oppløsningen gjennom et UV-Vis-spektrofotometer. Ekstinksjonskoeffisienten til AlPcS2a ved 672 nm er 4 x 104…

Representative Results

En skjematisk figur som representerer AlPcS 2a-indusert skade av IV, inkludert endosom og lysosom, er vist (figur 1). Kommersielt tilgjengelige markører kan brukes til å bestemme AlPcS2a-fargeforholdene . For eksempel AlPcS2a puncta og grønt fluorescerende fargestoff22 samlokalisering (figur 2). Fluoroformerket galektin-3 kan brukes som indikator f…

Discussion

AlPcS_2a binder seg til plasmamembranen, blir deretter internalisert ved endocytose og akkumuleres til slutt i lysosomer. AlPcS_2a kan dermed lokaliseres i de subcellulære rommene ved å justere inkubasjonsvarigheten. En begrensning av denne metoden er at bare en underpopulasjon av IV kan merkes av AlPcS_2a gjennom endocytose fordi det er mange andre membrankilder til IV, som ER og Golgi-apparater. I tillegg vil den selektive merkingen av AlPcS_2a i tidlige eller sene endosomer v?…

Materials

Reagent
Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a)	Frontier Scientific	P40632
Culture dish	ibidi	812128-200
Culture Medium			DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin
DMEM	Gibco	11965092
FBS	Thermo Fisher Scientific	A4736301
Gal3-GFP plasmid	addgene
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher Scientific	L3000008
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526	green fluorescent dye
Multiwall plate	perkinelmer	PK-6005550
NaOH	Thermo Fisher Scientific	Q15895
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	31985070
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140163
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	21600-069	137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4
Cell line
HeLa Cell Line	ATCC	CCL-2	The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually.
Equipments
0.22 µm Filter	Merck	SLGV013SL
Collimated LED Light  (660nm)	Thorlabs	M660L3-C1 and DC2100	Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a.
Confocal microscopy	Carl Zeiss	LSM 780	An incubation system is required for long-term imaging.
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermo Fisher Scientific
Red LED light	Tholabs	M660L4-C1