Un approccio fotodinamico per studiare la funzione della rottura della vescicola intracellulare
Summary
L’inattivazione laser assistita da cromoforo mediata da AlPcS2a (CALI) è un potente strumento per studiare il danno spaziotemporale delle vescicole intracellulari (IV) nelle cellule vive.
Abstract
Le vescicole intracellulari (IV) si formano attraverso l’endocitosi delle vescicole nel citoplasma. La formazione IV è coinvolta nell’attivazione di varie vie di segnale attraverso la permeabilizzazione delle membrane IV e la formazione di endosomi e lisosomi. Un metodo chiamato inattivazione laser assistita da cromoforo (CALI) viene applicato per studiare la formazione di IV e i materiali nel controllo della regolazione IV. CALI è una metodologia fotodinamica basata sull’imaging per studiare la via di segnalazione indotta dalla permeabilizzazione della membrana. Il metodo consente la manipolazione spaziotemporale dell’organello selezionato da permeabilizzare in una cellula. Il metodo CALI è stato applicato per osservare e monitorare molecole specifiche attraverso la permeabilizzazione di endosomi e lisosomi. La rottura della membrana delle flebo è nota per reclutare selettivamente proteine leganti i glicani, come la galectina-3. Qui, il protocollo descrive l’induzione della rottura IV da parte di AlPcS2a e l’uso della galectina-3 come marcatore per marcare i lisosomi alterati, che è utile nello studio degli effetti a valle della rottura della membrana IV e dei loro effetti a valle in varie situazioni.
Introduction
Gli endosomi, un tipo di vescicola intracellulare (IV), sono formati dall’endocitosi e poi maturano in lisosomi. Varie vie di segnale intracellulare sono coinvolte nella formazione delle flebo; inoltre, diversi stimoli intrinseci ed estrinseci possono danneggiare le flebo (ad esempio, i patogeni possono sfuggire dalla membrana limitata durante l’infezione ed entrare nel citoplasma1). Questo di solito è accompagnato dalla rottura delle vescicole endocitotiche2. Pertanto, le tecniche per colpire e danneggiare le flebo possono essere utilizzate in studi correlati3.
La terapia fotodinamica (PDT) è una terapia dipendente dalla luce per combattere le malattie uccidendo tumori o agenti patogeni4. Nella PDT, le cellule bersaglio sono marcate con cromofori non tossici, chiamati fotosensibilizzatori, che possono essere attivati localmente dall’illuminazione della luce 5,6. I fotosensibilizzatori assorbono energia dalla luce e si trasformano in uno stato di singoletto eccitato, portando allo stato di tripletta eccitata di lunga durata. I fotosensibilizzatori dello stato di tripletto possono subire un trasferimento di elettroni o energia e formare specie reattive dell’ossigeno (ROS) in presenza di ossigeno e possono distruggere spazialmente le cellule marcate all’interno della regione di illuminazione7. La conseguenza varia a seconda della potenza della luce8. Controllando la concentrazione di fotosensibilizzatori e l’intensità dell’illuminazione della luce, le biomolecole mirate possono essere inattivate selettivamente senza lisi cellulare, definita come inattivazione della luce assistita da cromofori (CALI)9. Con il significativo sviluppo di fotosensibilizzatori in grado di marcare selettivamente vari bersagli subcellulari, CALI è diventato uno strumento prezioso per controllare l’inattivazione mediata dalla luce di biomolecole per piccole biomolecole come nucleotidi e proteine, nonché organelli come mitocondri ed endolisosomi 3,10,11,12,13.
Rispetto al CALI, vengono utilizzati anche metodi chimici o fisici per compromettere le membrane, come la tossina batterica 14,15 e il trattamento Leu-Leu-OMe16 per il danno lisosomiale. Tuttavia, questi metodi mostrano una compromissione di massa delle flebo all’interno delle cellule. Fotosensibilizzanti robusti (cioè acido disolfonico cloruro di ftalocianina Al(III) (AlPcS2a)) sono utilizzati in CALI; AlPcS2a, che colpisce i lisosomi attraverso l’endocitosi, viene utilizzato per rompere endosomi o lisosomi in una regione controllata17. AlPcS2a è un cromoforo a base di ftalocianina impermeabile alla membrana cellulare che si lega ai lipidi sulla membrana plasmatica e viene internalizzato attraverso l’endocitosi e alla fine si accumula all’interno del lisosoma attraverso la via endocitica18. Assorbe la luce all’interno di una regione spettrale del vicino infrarosso e genera ossigeno singoletto, un importante ROS generato da AlPcS2a18 eccitato. Il decadimento dell’ossigeno singoletto limita rapidamente la sua diffusione e distanza di reazione all’interno di una piccola regione nelle cellule (circa 10-20 nm)19. Regolando la durata dell’incubazione di AlPcS2a e l’illuminazione della luce, è consentito il controllo spaziotemporale del danno delle flebo all’interno di un’area subcellulare. CALI diventa quindi un potente strumento per esaminare le conseguenze del danno IV e la formazione e la regolazione delle IV.
In questo studio, viene affrontato un protocollo specifico di CALI che utilizza AlPcS2a come fotosensibilizzatore. Questo protocollo può essere applicato a vari tipi di flebo, inclusi endosomi e lisosomi, e utilizzato per esaminare le risposte di follow-up dopo la rottura della membrana. Le cellule HeLa che esprimono galectina-3 coniugata con fluorofori 16,20 rivelate dopo la rottura del lisosoma sono utilizzate per dimostrare questo protocollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
AlPcS2a si lega alla membrana plasmatica, quindi viene internalizzato dall’endocitosi e alla fine si accumula nei lisosomi. AlPcS2a può quindi essere localizzato nei compartimenti subcellulari regolando la durata dell’incubazione. Una limitazione di questa metodologia è che solo una sottopopolazione di IV potrebbe essere marcata da AlPcS2a attraverso l’endocitosi perché ci sono molte altre fonti di membrana di IV, come l’apparato ER e di Golgi. Inoltre, la marcatura selettiva di AlPcS<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare l’Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS per il supporto alla ricerca. La struttura principale è finanziata dall’Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213). Gli autori ringraziano la Common Equipment Core Facility dell’Istituto di Scienze Biomediche (IBMS), Academia Sinica (AS) per aver assistito l’acquisizione delle immagini.
Materials
| Reagent | |||
| Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
| Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
| Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
| Cell line | |||
| HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
| Equipments | |||
| 0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
| Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |
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