Генетический скрининг для идентификации мультикопийных супрессоров в Schizosaccharomyces pombe
Summary
В этой работе описывается протокол для генетического скрининга мультикопийного супрессора в Schizosaccharomyces pombe. Этот экран использует библиотеку плазмид для всего генома для идентификации клонов-супрессоров фенотипа потери функции, связанного с мутантным штаммом запроса. Новые генетические супрессоры нулевого мутанта ell1 были идентифицированы с помощью этого экрана.
Abstract
Идентификация генетических взаимодействий является мощным инструментом для расшифровки функций гена (генов), предоставляя представление об их функциональных отношениях с другими генами и организации биологических путей и процессов. Хотя большинство генетических скринингов были первоначально разработаны в Saccharomyces cerevisiae, дополнительная платформа для проведения этих генетических скринингов была предоставлена Schizosaccharomyces pombe. Одним из распространенных подходов, используемых для идентификации генетических взаимодействий, является чрезмерная экспрессия клонов из общегеномной библиотеки плазмид с высоким числом копий в мутанте с потерей функции с последующим отбором клонов, которые подавляют фенотип мутанта.
В этой статье описывается протокол для проведения этого генетического скрининга на основе «подавления мультикопии» у S. pombe. Этот скрининг помог идентифицировать мультикопийный супрессор (ы) генотоксического стресс-чувствительного фенотипа, связанного с отсутствием фактора удлинения транскрипции Ell1 у S. pombe. Экран был инициирован преобразованием нулевого мутантного штамма запроса ell1 с библиотекой плазмид s. pombe cDNA с высоким числом копий и выбором супрессоров на пластинах EMM2, содержащих 4-нитрохинолин 1-оксид (4-NQO), генотоксическое стресс-индуцирующее соединение. Впоследствии плазмиду выделяли из двух колоний-супрессоров и переваривали ферментами рестрикции для высвобождения вставленной ДНК. Плазмиды, высвобождающие вставной фрагмент ДНК, были ретрансформированы в штамм делеции ell1 , чтобы подтвердить способность этих клонов плазмиды-супрессора восстанавливать рост мутанта делеции ell1 в присутствии 4-NQO и других генотоксических соединений. Те плазмиды, которые показали спасение фенотипа делеции, были секвенированы для идентификации гена (генов), ответственного за подавление генотоксического стресс-чувствительного фенотипа, связанного с делецией ell1 .
Introduction
Сети генетических взаимодействий предоставляют функциональную информацию о генах и очерчивают пути и биологические процессы, в которых эти гены могут быть вовлечены in vivo. Кроме того, они также могут дать представление о том, как различные гены взаимодействуют друг с другом, что приводит к определенному фенотипу 1,2,3. На протяжении многих лет исследователи разрабатывали различные генетические скрининги, чтобы ответить на фундаментальные биологические вопросы и изучить болезни человека. Скрининги для идентификации генетических взаимодействий могут быть выполнены несколькими способами. Генетические взаимодействия, идентифицированные в различных генетических скринингах, могут представлять собой различные механистические отношения между генами. Кроме того, исследования показали, что общий набор генетических взаимодействий разделяют гены, которые кодируют белки, принадлежащие к одному и тому же пути или комплексу 4,5. Таким образом, сети генетического взаимодействия могут быть использованы для установления функциональной организации в клетке, в которой гены, разделяющие наиболее похожие профили, принадлежат к одному и тому же комплексу или пути, эти гены, имеющие несколько менее похожие профили, принадлежат к одному и тому же биологическому процессу, а те гены, которые демонстрируют перекрывающиеся, но более разнообразные профили, отражают членов, принадлежащих к одному и тому же клеточному компартменту6.
Скрининги генетического взаимодействия, основанные на подавлении дозы («подавление высокой копии или мультикопии»), являются одним из широко используемых подходов. Эти экраны могут быть выполнены путем преобразования мутантного штамма запроса с помощью геномной библиотеки или библиотеки кДНК с высоким числом копий, за которой следуют подходящие анализы / методы отбора для выявления подавляющих или усиливающих генетических взаимодействий 7,8,9. Чтобы обеспечить всесторонний охват всего генома, эти скрининги также проводились путем сверхэкспрессии конкретного гена, представляющего интерес, в коллекции мутанта потери функции по всему геному или путем чрезмерной экспрессии геномной библиотеки с высоким числом копий плазмид или кДНК в мутанте запроса на потерю функции 9,10,11,12,13,14,15 . Стратегия мультикопии может также работать с использованием подхода доминанты/сверхвыражения с использованием регулируемого промотора.
Основные преимущества использования скринингов на основе супрессоров заключаются в том, что подавление ранее существовавшего фенотипа в мутантном штамме другим геном устанавливает генетическую связь между этими двумя генными продуктами, которая, возможно, не была продемонстрирована с использованием других подходов. Во-вторых, было замечено, что наличие ранее существовавшей мутации сенсибилизирует определенный путь, позволяя идентифицировать дополнительные компоненты этого пути путем выделения супрессоров, которые, возможно, не были идентифицированы более прямым генетическим отбором. Более того, этот экран может быть использован для идентификации подавителей, которые имеют различные механизмы подавления16. Супрессорные взаимодействия обычно происходят между генами, которые функционально связаны и могут быть использованы для выяснения иерархий в путях. Точный основной механизм подавления может отличаться в зависимости от нескольких факторов, включая тип мутанта запроса, используемого на экране, экспериментальные условия и уровень экспрессии генов. Один из распространенных механизмов подавления дозы включает гены, кодирующие продукты, которые функционируют вместе в одном комплексе или параллельно в одном и том же клеточном / биологическом процессе. Результаты таких скринингов в более простых модельных организмах, таких как дрожжи, могут быть распространены на высшие эукариотические организмы, поскольку большинство фундаментальных биологических путей и процессов сохраняются на протяжении всей эволюции.
Эти генетические экраны также могут быть модифицированы несколькими способами, чтобы ответить на различные биологические вопросы. Например, могут быть идентифицированы ортологичные гены разных организмов, которые могут подавлять фенотип мутантного штамма. Он также был использован для определения потенциальных механизмов резистентности и определения белковых мишеней новых антибактериальныхсоединений 17,18, противогрибковых19,20, противопаразитарных21 и противоопухолевыхсоединений 22. Этот экран также был использован для выявления супрессоров активности фармацевтических препаратов, механизм действия которых неизвестен. Таким образом, в принципе, эти мультикопийные супрессорные экраны могут быть оптимизированы и использованы в различных приложениях в различных организмах. Хотя большинство генетических скринингов, используемых исследователями дрожжей, были первоначально разработаны в S. cerevisiae, S. pombe появился как дополнительная модельная система для проведения различных генетических скринингов и анализов23. Кроме того, геномная организация и биологические процессы у S. pombe, такие как встречаемость интронов в большем количестве генов, сложность происхождения репликации ДНК, структура центромеры, организация клеточного цикла и наличие механизма RNAi, показывают большее сходство между S. pombe и высшими эукариотами23,24, подчеркивая важность разработки и использования генетических инструментов в S. pombe.
В этой статье описывается протокол идентификации генетических интеракторов на основе «подавления дозы» мутантного фенотипа с потерей функции у S. pombe. Основой этого протокола является то, что это быстрый и эффективный метод скрининга библиотеки кДНК, чрезмерно экспрессирующей гены дикого типа либо на мультикопийной плазмиде, либо на сильном промоторе. Этот протокол состоит из четырех основных этапов: преобразование библиотеки в мутантный штамм запроса, выбор плазмидных клонов, которые подавляют желаемый фенотип мутантного штамма запроса, извлечение плазмиды (плазмид) из этих клонов-супрессоров и идентификация гена, ответственного за подавление фенотипа. Как и для любого метода, основанного на выборе и идентификации cDNAs из библиотеки, успех экрана зависит от использования высококачественной и сложной библиотеки, поскольку экран может извлекать только те клоны кДНК, которые присутствуют в библиотеке.
Используя этот протокол, мы успешно идентифицировали два новых супрессора генотоксического стресс-чувствительного фенотипа запроса S. pombe ell1 нулевого мутанта. Семейство факторов удлинения транскрипции ELL (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) подавляет преходящую паузу РНК-полимеразы II на шаблонах ДНК в биохимических анализах in vitro и сохраняется в различных организмах, от дрожжей деления до людей25. Более ранняя работа предоставила доказательства того, что нулевой мутант S. pombe ell1 демонстрирует генотоксическую стрессовую чувствительность в присутствии 4-нитрохинолина 1-оксида (4-NQO) и метилметансульфоната (MMS)26. Поэтому мы преобразовали мультикопийную библиотеку кДНК, кодируемую плазмидой S. pombe , в нулевой мутант S. pombe ell1 и идентифицировали два предполагаемых клона, которые продемонстрировали способность подавлять генотоксическую стрессовую чувствительность нулевого мутанта S. pombe ell1 в присутствии 4-NQO, соединения, которое индуцирует поражения ДНК. Последующее секвенирование вставки, присутствующей в плазмидных клонах, показало, что гены, кодирующие rax2+ и osh6+, были ответственны за подавление генотоксической стрессовой чувствительности нулевого мутанта ell1 при сверхэкспрессии в нулевом мутанте ell1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Дрожжи широко используются для исследования основных биологических процессов и путей, которые эволюционно сохраняются в эукариотических организмах. Наличие генетических и геномных инструментов наряду с их пригодностью к различным биохимическим, генетическим и молекулярным процеду…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась за счет исследовательского гранта Департамента биотехнологии правительства Индии (грант No. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) — Нимише Шарме. Авторы благодарят профессора Чарльза Хоффмана (Бостонский колледж, США) за дар библиотеки кДНК S. pombe и профессора Сьюзан Форсбург за дрожжевые плазмиды.
Materials
| 4-NQO | Sigma | N8141 | |
| Acetic Acid, glacial | Sigma | 1371301000 | |
| Adenine Sulphate | Himedia | GRM033 | |
| Agar | Himedia | GRM026 | |
| Agarose | Lonza | 50004L | |
| Ammonium Chloride | Himedia | MB054 | |
| BamHI | Fermentas | ER0051 | |
| Biotin | Himedia | RM095 | |
| Boric Acid | Himedia | MB007 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C4901 | |
| Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma | C0549 | |
| Citric Acid | Himedia | RM1023 | |
| Disodium hydrogen phospahte anhydrous | Himedia | GRM3960 | |
| single stranded DNA from Salmon testes | Sigma | D7656 | |
| EDTA disodium | Sigma | 324503 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Himedia | RM6353 | |
| Glucose | Amresco | 188 | |
| Ionositol | Himedia | GRM102 | |
| Isopropanol | Qualigen | Q26897 | |
| Leucine | Himedia | GRM054 | |
| Lithium Acetatae | Sigma | 517992 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Himedia | MB040 | |
| Molybdic Acid | Himedia | RM690 | |
| Nicotinic Acid | Himedia | CMS177 | |
| PEG, MW 4000 | Sigma | 81240 | |
| Pentothinic Acid | Himedia | TC159 | |
| Phenol | Himedia | MB082 | |
| Plasmid Extraction Kit | Qiagen | 27104 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Potassium hydrogen Pthallate | Merc | DDD7D670815 | |
| Potassium iodide | Himedia | RM1086 | |
| RNAse | Fermentas | EN0531 | |
| SDS | Himedia | GRM205 | |
| Sodium Hydroxide | Himedia | GRM1183 | |
| Sodium Sulphate | Himedia | RM1037 | |
| Tris free Base | Himedia | MB209 | |
| Uracil | Himedia | GRM264 | |
| Yeast Extract Powder | Himedia | RM668 | |
| Zinc Sulphate Heptahydrate | Merc | DJ9D692580 |
References
- Zuk, O., Hechter, E., Sunyaev, S. R., Lander, E. S. The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1193-1198 (2012).
- Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. -. L. V., Kruglyak, L. Finding the sources of missing heritability in a yeast cross. Nature. 494 (7436), 234-237 (2013).
- Bloom, J. S., et al. Genetic interactions contribute less than additive effects to quantitative trait variation in yeast. Nature Communications. 6 (1), 8712 (2015).
- Tong, A. H. Y., et al. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303 (5659), 808-813 (2004).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), 425-431 (2010).
- Costanzo, M., et al. A global genetic interaction network maps a wiring diagram of cellular function. Science. 353 (6306), (2016).
- Mullen, J. R., Kaliraman, V., Ibrahim, S. S., Brill, S. J. Requirement for three novel protein complexes in the absence of the Sgs1 DNA helicase in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (1), 103-118 (2001).
- Kaplan, Y., Kupiec, M. A role for the yeast cell cycle/splicing factor Cdc40 in the G1/S transition. Current Genetics. 51 (2), 123-140 (2007).
- Carlsson, M., Hu, G. -. Z., Ronne, H. Gene dosage effects in yeast support broader roles for the LOG1, HAM1 and DUT1 genes in detoxification of nucleotide analogues. PLOS One. 13 (5), 0196840 (2018).
- Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Molecular Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
- Duffy, S., et al. Overexpression screens identify conserved dosage chromosome instability genes in yeast and human cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 9967-9976 (2016).
- Appling, D. R. Genetic approaches to the study of protein-protein interactions. Methods (San Diego, Calif). 19 (2), 338-349 (1999).
- Forsburg, S. L. The art and design of genetic screens: yeast. Nature Reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).
- Kitazono, A. A., Tobe, B. T. D., Kalton, H., Diamant, N., Kron, S. J. Marker-fusion PCR for one-step mutagenesis of essential genes in yeast. Yeast (Chichester, England). 19 (2), 141-149 (2002).
- Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nature Reviews. Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).
- Prelich, G. Suppression mechanisms: themes from variations. Trends in Genetics. 15 (7), 261-266 (1999).
- Li, X., et al. Multicopy suppressors for novel antibacterial compounds reveal targets and drug efflux susceptibility. Chemistry & Biology. 11 (10), 1423-1430 (2004).
- Apfel, C. M., et al. Peptide deformylase as an antibacterial drug target: Target validation and resistance development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1058-1064 (2001).
- Tsukahara, K., et al. Medicinal genetics approach towards identifying the molecular target of a novel inhibitor of fungal cell wall assembly. Molecular Microbiology. 48 (4), 1029-1042 (2003).
- Calabrese, D., Bille, J., Sanglard, D. A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans (FLU1) conferring resistance to fluconazole. Microbiology. 146 (11), 2743-2754 (2000).
- Cotrim, P. C., Garrity, L. K., Beverley, S. M. Isolation of genes mediating resistance to inhibitors of nucleoside and ergosterol metabolism in leishmania by overexpression/selection. Journal of Biological Chemistry. 274 (53), 37723-37730 (1999).
- Nodake, Y., Yamasaki, N. Some properties of a macromolecular conjugate of lysozyme prepared by modification with a monomethoxypolyethylene glycol derivative. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (4), 767-774 (2000).
- Sunnerhagen, P. Prospects for functional genomics in Schizosaccharomyces pombe. Current Genetics. 42 (2), 73-84 (2002).
- Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
- Sharma, N. Regulation of RNA polymerase II-mediated transcriptional elongation: Implications in human disease. IUBMB Life. 68 (9), 709-716 (2016).
- Sweta, K., Dabas, P., Jain, K., Sharma, N. The amino-terminal domain of ELL transcription elongation factor is essential for ELL function in Schizosaccharomyces pombe. Microbiology. 163 (11), 1641-1653 (2017).
- Murray, J. M., Watson, A. T., Carr, A. M. Transformation of Schizosaccharomyces pombe: Lithium acetate/dimethyl sulfoxide procedure. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 090969 (2016).
- Hagan, I., Carr, A. M., Grallert, A., Nurse, P. . Fission yeast: a laboratory manual. , (2016).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and transformation of competent E. coli using calcium chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 3932 (2006).
- Janoo, R. T., Neely, L. A., Braun, B. R., Whitehall, S. K., Hoffman, C. S. Transcriptional regulators of the Schizosaccharomyces pombefbp1 gene include two redundant Tup1p-like corepressors and the CCAAT binding factor activation complex. Genetics. 157 (3), 1205-1215 (2001).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of plasmid DNA by alkaline lysis with SDS: Maxipreparation. CSH Protocols. 2006 (1), 4090 (2006).
- Choi, E., Lee, K., Song, K. Function of rax2p in the polarized growth of fission yeast. Molecules and Cells. 22 (2), 146-153 (2006).
- Eisenreichova, A., Różycki, B., Boura, E., Humpolickova, J. Osh6 revisited: Control of PS transport by the concerted actions of PI4P and Sac1 phosphatase. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 747601 (2021).
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Forsburg, S. L. The yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe: models for cell biology research. Gravitational and Space Biology Bulletin: Publication of the American Society for Gravitational and Space Biology. 18 (2), 3-9 (2005).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
- Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nature Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
- Kitada, K., Johnson, A. L., Johnston, L. H., Sugino, A. A multicopy suppressor gene of the Saccharomyces cerevisiae G1 cell cycle mutant gene dbf4 encodes a protein kinase and is identified as CDC5. Molecular and Cellular Biology. 13 (7), 4445-4457 (1993).
- Melnykov, A. V., Elson, E. L. . MCH4 is a multicopy suppressor of glycine toxicity in Saccharomyces cerevisiae. , 653444 (2019).
- Kosodo, Y., et al. Multicopy suppressors of the sly1 temperature-sensitive mutation in the ER-Golgi vesicular transport in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 18 (11), 1003-1014 (2001).
- Nakamura, T., Takahashi, S., Takagi, H., Shima, J. Multicopy suppression of oxidant-sensitive eos1 mutation by IZH2 in Saccharomyces cerevisiae and the involvement of Eos1 in zinc homeostasis: Eos1 involvement in zinc homeostasis. FEMS Yeast Research. 10 (3), 259-269 (2010).
- Hernández-López, M. J., García-Marqués, S., Randez-Gil, F., Prieto, J. A. Multicopy suppression screening of Saccharomyces cerevisiae identifies the ubiquitination machinery as a main target for improving growth at low temperatures. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7517-7525 (2011).
- Sweta, K., Sharma, N. Functional interaction between ELL transcription elongation factor and Epe1 reveals the role of Epe1 in the regulation of transcription outside heterochromatin. Molecular Microbiology. 116 (1), 80-96 (2021).
- Kim, D. -. U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 617-623 (2010).
- Adames, N. R., Gallegos, J. E., Peccoud, J. Yeast genetic interaction screens in the age of CRISPR/Cas. Current Genetics. 65 (2), 307-327 (2019).
