В этой работе описывается протокол для генетического скрининга мультикопийного супрессора в Schizosaccharomyces pombe. Этот экран использует библиотеку плазмид для всего генома для идентификации клонов-супрессоров фенотипа потери функции, связанного с мутантным штаммом запроса. Новые генетические супрессоры нулевого мутанта ell1 были идентифицированы с помощью этого экрана.
Идентификация генетических взаимодействий является мощным инструментом для расшифровки функций гена (генов), предоставляя представление об их функциональных отношениях с другими генами и организации биологических путей и процессов. Хотя большинство генетических скринингов были первоначально разработаны в Saccharomyces cerevisiae, дополнительная платформа для проведения этих генетических скринингов была предоставлена Schizosaccharomyces pombe. Одним из распространенных подходов, используемых для идентификации генетических взаимодействий, является чрезмерная экспрессия клонов из общегеномной библиотеки плазмид с высоким числом копий в мутанте с потерей функции с последующим отбором клонов, которые подавляют фенотип мутанта.
В этой статье описывается протокол для проведения этого генетического скрининга на основе «подавления мультикопии» у S. pombe. Этот скрининг помог идентифицировать мультикопийный супрессор (ы) генотоксического стресс-чувствительного фенотипа, связанного с отсутствием фактора удлинения транскрипции Ell1 у S. pombe. Экран был инициирован преобразованием нулевого мутантного штамма запроса ell1 с библиотекой плазмид s. pombe cDNA с высоким числом копий и выбором супрессоров на пластинах EMM2, содержащих 4-нитрохинолин 1-оксид (4-NQO), генотоксическое стресс-индуцирующее соединение. Впоследствии плазмиду выделяли из двух колоний-супрессоров и переваривали ферментами рестрикции для высвобождения вставленной ДНК. Плазмиды, высвобождающие вставной фрагмент ДНК, были ретрансформированы в штамм делеции ell1 , чтобы подтвердить способность этих клонов плазмиды-супрессора восстанавливать рост мутанта делеции ell1 в присутствии 4-NQO и других генотоксических соединений. Те плазмиды, которые показали спасение фенотипа делеции, были секвенированы для идентификации гена (генов), ответственного за подавление генотоксического стресс-чувствительного фенотипа, связанного с делецией ell1 .
Сети генетических взаимодействий предоставляют функциональную информацию о генах и очерчивают пути и биологические процессы, в которых эти гены могут быть вовлечены in vivo. Кроме того, они также могут дать представление о том, как различные гены взаимодействуют друг с другом, что приводит к определенному фенотипу 1,2,3. На протяжении многих лет исследователи разрабатывали различные генетические скрининги, чтобы ответить на фундаментальные биологические вопросы и изучить болезни человека. Скрининги для идентификации генетических взаимодействий могут быть выполнены несколькими способами. Генетические взаимодействия, идентифицированные в различных генетических скринингах, могут представлять собой различные механистические отношения между генами. Кроме того, исследования показали, что общий набор генетических взаимодействий разделяют гены, которые кодируют белки, принадлежащие к одному и тому же пути или комплексу 4,5. Таким образом, сети генетического взаимодействия могут быть использованы для установления функциональной организации в клетке, в которой гены, разделяющие наиболее похожие профили, принадлежат к одному и тому же комплексу или пути, эти гены, имеющие несколько менее похожие профили, принадлежат к одному и тому же биологическому процессу, а те гены, которые демонстрируют перекрывающиеся, но более разнообразные профили, отражают членов, принадлежащих к одному и тому же клеточному компартменту6.
Скрининги генетического взаимодействия, основанные на подавлении дозы («подавление высокой копии или мультикопии»), являются одним из широко используемых подходов. Эти экраны могут быть выполнены путем преобразования мутантного штамма запроса с помощью геномной библиотеки или библиотеки кДНК с высоким числом копий, за которой следуют подходящие анализы / методы отбора для выявления подавляющих или усиливающих генетических взаимодействий 7,8,9. Чтобы обеспечить всесторонний охват всего генома, эти скрининги также проводились путем сверхэкспрессии конкретного гена, представляющего интерес, в коллекции мутанта потери функции по всему геному или путем чрезмерной экспрессии геномной библиотеки с высоким числом копий плазмид или кДНК в мутанте запроса на потерю функции 9,10,11,12,13,14,15 . Стратегия мультикопии может также работать с использованием подхода доминанты/сверхвыражения с использованием регулируемого промотора.
Основные преимущества использования скринингов на основе супрессоров заключаются в том, что подавление ранее существовавшего фенотипа в мутантном штамме другим геном устанавливает генетическую связь между этими двумя генными продуктами, которая, возможно, не была продемонстрирована с использованием других подходов. Во-вторых, было замечено, что наличие ранее существовавшей мутации сенсибилизирует определенный путь, позволяя идентифицировать дополнительные компоненты этого пути путем выделения супрессоров, которые, возможно, не были идентифицированы более прямым генетическим отбором. Более того, этот экран может быть использован для идентификации подавителей, которые имеют различные механизмы подавления16. Супрессорные взаимодействия обычно происходят между генами, которые функционально связаны и могут быть использованы для выяснения иерархий в путях. Точный основной механизм подавления может отличаться в зависимости от нескольких факторов, включая тип мутанта запроса, используемого на экране, экспериментальные условия и уровень экспрессии генов. Один из распространенных механизмов подавления дозы включает гены, кодирующие продукты, которые функционируют вместе в одном комплексе или параллельно в одном и том же клеточном / биологическом процессе. Результаты таких скринингов в более простых модельных организмах, таких как дрожжи, могут быть распространены на высшие эукариотические организмы, поскольку большинство фундаментальных биологических путей и процессов сохраняются на протяжении всей эволюции.
Эти генетические экраны также могут быть модифицированы несколькими способами, чтобы ответить на различные биологические вопросы. Например, могут быть идентифицированы ортологичные гены разных организмов, которые могут подавлять фенотип мутантного штамма. Он также был использован для определения потенциальных механизмов резистентности и определения белковых мишеней новых антибактериальныхсоединений 17,18, противогрибковых19,20, противопаразитарных21 и противоопухолевыхсоединений 22. Этот экран также был использован для выявления супрессоров активности фармацевтических препаратов, механизм действия которых неизвестен. Таким образом, в принципе, эти мультикопийные супрессорные экраны могут быть оптимизированы и использованы в различных приложениях в различных организмах. Хотя большинство генетических скринингов, используемых исследователями дрожжей, были первоначально разработаны в S. cerevisiae, S. pombe появился как дополнительная модельная система для проведения различных генетических скринингов и анализов23. Кроме того, геномная организация и биологические процессы у S. pombe, такие как встречаемость интронов в большем количестве генов, сложность происхождения репликации ДНК, структура центромеры, организация клеточного цикла и наличие механизма RNAi, показывают большее сходство между S. pombe и высшими эукариотами23,24, подчеркивая важность разработки и использования генетических инструментов в S. pombe.
В этой статье описывается протокол идентификации генетических интеракторов на основе «подавления дозы» мутантного фенотипа с потерей функции у S. pombe. Основой этого протокола является то, что это быстрый и эффективный метод скрининга библиотеки кДНК, чрезмерно экспрессирующей гены дикого типа либо на мультикопийной плазмиде, либо на сильном промоторе. Этот протокол состоит из четырех основных этапов: преобразование библиотеки в мутантный штамм запроса, выбор плазмидных клонов, которые подавляют желаемый фенотип мутантного штамма запроса, извлечение плазмиды (плазмид) из этих клонов-супрессоров и идентификация гена, ответственного за подавление фенотипа. Как и для любого метода, основанного на выборе и идентификации cDNAs из библиотеки, успех экрана зависит от использования высококачественной и сложной библиотеки, поскольку экран может извлекать только те клоны кДНК, которые присутствуют в библиотеке.
Используя этот протокол, мы успешно идентифицировали два новых супрессора генотоксического стресс-чувствительного фенотипа запроса S. pombe ell1 нулевого мутанта. Семейство факторов удлинения транскрипции ELL (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) подавляет преходящую паузу РНК-полимеразы II на шаблонах ДНК в биохимических анализах in vitro и сохраняется в различных организмах, от дрожжей деления до людей25. Более ранняя работа предоставила доказательства того, что нулевой мутант S. pombe ell1 демонстрирует генотоксическую стрессовую чувствительность в присутствии 4-нитрохинолина 1-оксида (4-NQO) и метилметансульфоната (MMS)26. Поэтому мы преобразовали мультикопийную библиотеку кДНК, кодируемую плазмидой S. pombe , в нулевой мутант S. pombe ell1 и идентифицировали два предполагаемых клона, которые продемонстрировали способность подавлять генотоксическую стрессовую чувствительность нулевого мутанта S. pombe ell1 в присутствии 4-NQO, соединения, которое индуцирует поражения ДНК. Последующее секвенирование вставки, присутствующей в плазмидных клонах, показало, что гены, кодирующие rax2+ и osh6+, были ответственны за подавление генотоксической стрессовой чувствительности нулевого мутанта ell1 при сверхэкспрессии в нулевом мутанте ell1.
Дрожжи широко используются для исследования основных биологических процессов и путей, которые эволюционно сохраняются в эукариотических организмах. Наличие генетических и геномных инструментов наряду с их пригодностью к различным биохимическим, генетическим и молекулярным процеду…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась за счет исследовательского гранта Департамента биотехнологии правительства Индии (грант No. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) — Нимише Шарме. Авторы благодарят профессора Чарльза Хоффмана (Бостонский колледж, США) за дар библиотеки кДНК S. pombe и профессора Сьюзан Форсбург за дрожжевые плазмиды.
4-NQO | Sigma | N8141 | |
Acetic Acid, glacial | Sigma | 1371301000 | |
Adenine Sulphate | Himedia | GRM033 | |
Agar | Himedia | GRM026 | |
Agarose | Lonza | 50004L | |
Ammonium Chloride | Himedia | MB054 | |
BamHI | Fermentas | ER0051 | |
Biotin | Himedia | RM095 | |
Boric Acid | Himedia | MB007 | |
Calcium Chloride | Sigma | C4901 | |
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 | Sigma | C0549 | |
Citric Acid | Himedia | RM1023 | |
Disodium hydrogen phospahte anhydrous | Himedia | GRM3960 | |
single stranded DNA from Salmon testes | Sigma | D7656 | |
EDTA disodium | Sigma | 324503 | |
Ferric Chloride Hexahydrate | Himedia | RM6353 | |
Glucose | Amresco | 188 | |
Ionositol | Himedia | GRM102 | |
Isopropanol | Qualigen | Q26897 | |
Leucine | Himedia | GRM054 | |
Lithium Acetatae | Sigma | 517992 | |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Himedia | MB040 | |
Molybdic Acid | Himedia | RM690 | |
Nicotinic Acid | Himedia | CMS177 | |
PEG, MW 4000 | Sigma | 81240 | |
Pentothinic Acid | Himedia | TC159 | |
Phenol | Himedia | MB082 | |
Plasmid Extraction Kit | Qiagen | 27104 | |
Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
Potassium hydrogen Pthallate | Merc | DDD7D670815 | |
Potassium iodide | Himedia | RM1086 | |
RNAse | Fermentas | EN0531 | |
SDS | Himedia | GRM205 | |
Sodium Hydroxide | Himedia | GRM1183 | |
Sodium Sulphate | Himedia | RM1037 | |
Tris free Base | Himedia | MB209 | |
Uracil | Himedia | GRM264 | |
Yeast Extract Powder | Himedia | RM668 | |
Zinc Sulphate Heptahydrate | Merc | DJ9D692580 |