Differenzierte Mausadipozyten in Primärkultur: ein Modell der Insulinresistenz

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Präadipozyten der Maus aus subkutanem Fett, ihre Differenzierung in reife Adipozyten und die Induktion einer Insulinresistenz. Die Insulinwirkung wird durch die Phosphorylierung/Aktivierung von Mitgliedern des Insulin-Signalwegs durch Western Blot bewertet. Diese Methode ermöglicht die direkte Bestimmung der Insulinresistenz/-sensitivität in primären Adipozyten.

Abstract

Insulinresistenz ist eine verminderte Wirkung von Insulin auf seine Zielzellen, die in der Regel auf eine verminderte Signalübertragung der Insulinrezeptoren zurückzuführen ist. Insulinresistenz trägt zur Entwicklung von Typ-2-Diabetes (T2D) und anderen durch Fettleibigkeit verursachten Krankheiten mit hoher Prävalenz weltweit bei. Daher ist es von großer Relevanz, die Mechanismen zu verstehen, die der Insulinresistenz zugrunde liegen. Mehrere Modelle wurden verwendet, um die Insulinresistenz sowohl in vivo als auch in vitro zu untersuchen. Primäre Adipozyten stellen eine attraktive Option dar, um die Mechanismen der Insulinresistenz zu untersuchen und Moleküle zu identifizieren, die diesem Zustand entgegenwirken, sowie die molekularen Ziele von insulinsensibilisierenden Medikamenten. In dieser Arbeit haben wir ein Insulinresistenzmodell mit primären Adipozyten in Kulturen etabliert, die mit Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) behandelt wurden.

Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs), die aus Kollagenase-verdautem subkutanem Fettgewebe der Maus mittels Magnetzelltrennungstechnologie isoliert wurden, werden in primäre Adipozyten differenziert. Die Insulinresistenz wird dann durch die Behandlung mit TNF-α induziert, einem proinflammatorischen Zytokin, das die Tyrosinphosphorylierung/-aktivierung von Mitgliedern der Insulinsignalkaskade reduziert. Die verminderte Phosphorylierung des Insulinrezeptors (IR), des Insulinrezeptorsubstrats (IRS-1) und der Proteinkinase B (AKT) wird mittels Western Blot quantifiziert. Diese Methode bietet ein hervorragendes Werkzeug, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Insulinresistenz im Fettgewebe vermitteln.

Introduction

Insulin ist ein anaboles Hormon, das von den β-Zellen der Pankreasinsel produziert wird und der Schlüsselregulator des Glukose- und Fettstoffwechsels ist. Insulin reguliert unter anderem die Glukoseaufnahme, die Glykogensynthese, die Gluconeogenese, die Proteinsynthese, die Lipogenese und die Lipolyse¹. Das erste molekulare Signal nach der Interaktion von Insulin mit seinem Rezeptor (IR) ist die Aktivierung der intrinsischen Tyrosinkinase-Aktivität von IR², was zu seiner Autophosphorylierung³ und der anschließenden Aktivierung einer Familie von Proteinen führt, die als Insulinrezeptorsubstrate (IRS) bekannt sind und an Adapterproteine binden, was zur Aktivierung einer Kaskade von Proteinkinasen^{führt 4} . Insulin aktiviert zwei Hauptsignalwege: die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K)-Proteinkinase B (AKT) und die Ras-Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK). Ersterer stellt einen wichtigen Verzweigungspunkt oder Knoten ^4,5 für die Aktivierung zahlreicher nachgeschalteter Effektoren dar, die an verschiedenen physiologischen Funktionen beteiligt sind, einschließlich der Regulation der Brennstoffhomöostase, während letzterer das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung reguliert ^4,6. Die Insulinwirkung hängt letztendlich vom Zelltyp und dem physiologischen Kontext ab⁷.

Eines der wichtigsten insulinempfindlichen Stoffwechselgewebe ist das Fettgewebe. Weißes Fettgewebe ist die am häufigsten vorkommende Art von Fett bei Menschen und Nagetieren, verteilt in subkutanem Fett (zwischen Haut und Muskeln) und viszeralem Fett (um die Organe in der Bauchhöhle). Aufgrund ihres großen Volumens sind Adipozyten oder Fettzellen der am häufigsten vorkommende Zelltyp im Fettgewebe. Diese Fettzellen können braun/beige (thermogen), rosa (in der Brustdrüse) und weiß sein ^8,9. Weiße Adipozyten halten die wichtigsten Energiereserven im Körper in Form von Triglyceriden, einem insulinabhängigen Prozess. Insulin fördert den Glukosetransport und die Lipogenese, während es die Lipolyse oder den Lipidabbau hemmt ^7,10. Es erleichtert auch die Differenzierung von Präadipozyten in Adipozyten – die reifen fettspeichernden Zellen¹¹.

Eine Insulinresistenz tritt auf, wenn ein normaler Insulinspiegel eine abgeschwächte biologische Reaktion hervorruft, was zu einer kompensatorischen Hyperinsulinämie führt¹². Insulinresistenz ist eine Erkrankung, die mit Übergewicht und Adipositas einhergeht⁵ und in Kombination zu Typ-2-Diabetes (T2D) und anderen Stoffwechselerkrankungen führt¹³. Hyperinsulinämie kompensiert die Insulinresistenz im peripheren Gewebe, um einen normalen Blutzuckerspiegel aufrechtzuerhalten¹⁴. Ein eventueller Verlust oder eine Erschöpfung β Zellen führt jedoch zusammen mit einer verschlimmerten Insulinresistenz zu erhöhten Blutzuckerspiegeln, die mit T2D⁵ übereinstimmen. Daher können Insulinresistenz und Hyperinsulinämie zur Entwicklung von Adipositas-bedingten Stoffwechselerkrankungen beitragen¹⁵. Darüber hinaus kann Adipositas eine chronische, niedriggradige lokale Entzündung verursachen, die die Insulinresistenz im Fettgewebe fördert^15,16,17. Darüber hinaus führen durch Fettleibigkeit verursachte Veränderungen des Fettgewebes, wie z. B. Fibrose, Entzündungen und eine verminderte Angiogenese und Adipogenese, zu niedrigeren Adiponektin-Serumspiegeln (einem Insulinsensibilisator) und einer erhöhten Sekretion von Faktoren wie dem Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 1 (PAI-1), freien Fettsäuren und Exosomen in den Blutkreislauf, was die Insulinresistenz verschlimmert¹⁷.

Viele Aspekte, die der Insulinresistenz zugrunde liegen, sind noch unbekannt. In-vitro– und In-vivo-Modelle wurden entwickelt, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Insulinresistenz in wichtigen Zielgeweben, einschließlich des Fettgewebes, vermitteln. Der Vorteil von In-vitro-Modellen besteht darin, dass die Forscher die Umweltbedingungen besser kontrollieren und die Insulinresistenz in bestimmten Zelltypen beurteilen können. Insbesondere Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs) weisen den individuellen Phänotyp des Spendergewebes auf, der die Physiologie besser widerspiegeln könnte als Adipozyten-Zelllinien. Ein Hauptfaktor, der die Insulinresistenz in vitro induziert, ist der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α). TNF-α ist ein proinflammatorisches Zytokin, das von Adipozyten und Makrophagen im Fettgewebe sezerniert^{wird 18}. Während es für den korrekten Umbau und die Expansion des Fettgewebes erforderlich ist¹⁹, induziert eine langfristige Exposition gegenüber TNF-α eine Insulinresistenz im Fettgewebe in vivo und in Adipozyten in vitro²⁰. Die chronische TNF-α-Behandlung verschiedener Zelltypen führt zu einer erhöhten Serinphosphorylierung sowohl von IR als auch von IRS-1, wodurch eine verminderte Tyrosinphosphorylierung gefördert^{wird 21}. Eine erhöhte Phosphorylierung von IRS-1 auf Serinresten hemmt die Aktivität der IR-Tyrosinkinase und könnte einer der Schlüsselmechanismen sein, durch die eine chronische TNF-α-Behandlung die Insulinwirkung beeinträchtigt^22,23. TNF-α aktiviert Signalwege, die den Serin/Threonin-Kinase-Inhibitor der nukleären Faktor-ĸB-Kinase β (IKKβ) und der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK) ^betreffen24. JNK induziert ein komplexes proinflammatorisches Transkriptionsprogramm, phosphoryliert aber auch direkt IRS-1⁶.

Das Verständnis der Pathogenese der Insulinresistenz wird immer wichtiger, um die Entwicklung zukünftiger Therapien gegen T2D zu steuern. APCs haben sich als hervorragendes Modell für die Untersuchung der Fettzellbiologie, einschließlich der Sensitivität und Resistenz gegenüber Insulin, und für die Identifizierung der intrinsischen Eigenschaften von Adipozyten unabhängig von der systemischen Umgebung erwiesen. APCs können leicht aus verschiedenen Fettdepots gewonnen und unter geeigneten Bedingungen in reife Adipozyten differenziert werden. Mit dieser Methode können direkte Effekte auf die Insulinresistenz/-sensitivität in Adipozyten untersucht werden.

Protocol

Alle Nagetierexperimente wurden von der Bioethikkommission des Instituts für Neurobiologie der UNAM, Protokollnummer 075, genehmigt. 1. Isolierung von Adipozyten-Vorläuferzellen der Maus 8-10 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse einschläfern (z. B. durch CO2 -Inhalation und anschließende Zervixluxation) (vier Tiere pro Isolierung). Desinfizieren Sie die Mäuse durch Einreiben mit 70%igem Ethanol und erhalten Sie das Fettgewebe sofort nach der Opferung…

Representative Results

Die zunehmende Prävalenz von Adipositas und T2D hat in den letzten Jahren zu einer intensiven Suche nach den Mechanismen geführt, die die Insulinresistenz im Fettgewebe vermitteln. Mit dem hier beschriebenen Protokoll können APCs in reife Adipozyten differenziert werden, um die Insulinresistenz und -sensitivität zu bewerten. Sobald die APCs die Konfluenz erreicht haben, dauert es 10 Tage, bis ihre Differenzierung in reife Adipozyten und ihre TNF-α-vermittelte Induktion der Insulinresistenz abgeschlossen sind (<stron…

Discussion

In dieser Arbeit wird eine Methode zur Untersuchung der Insulinresistenz vorgestellt, bei der primäre Adipozyten in Kulturen verwendet werden, die mit TNF-α behandelt wurden. Dieses Modell hat den Vorteil, dass primäre Adipozyten unter definierten Bedingungen über lange Zeiträume mit einer strengen Kontrolle zellulärer Umweltfaktoren kultiviert werden können²⁶. Die Testdauer beträgt 15-20 Tage, obwohl es zwischen den Experimenten zu Abweichungen im Prozentsatz der differenzierten Adipozyte…

Materials

1. Isolation mouse adipocyte precursor cells
ACK lysing buffer	LONZA	10-548E
Anti-Biotin Microbeads	Miltenyi	130-090-485
Anti-CD31	eBioscience	13-0311-85
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi
Basement membrane matrix (matrigel)	Corning	354234
bFGF	Sigma	F0291	Growth factor
BSA	Equitech-Bio, Inc.	BAC63-1000
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) – Biotin	eBioscience	13-0451-85
Collagenase, Type 1	Worthington Biochem	LS004197
Dexamethasone	Sigma	D1756
DMEM	GIBCO	12800017
DMEM low glucose	GIBCO	31600-034
EGF	Peprotech	315-09	Growth factor
FBS	GIBCO	26140-079
ITS mix	Sigma	I3146
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma	A8960
LIF	Millipore	ESG1107	Growth factor
Linoleic acid-albumin	Sigma	L9530
MCDB 201 medium	Sigma	M6770
Normocin	InvivoGen	ant-nr-2
PDGF-BB	Peprotech	315-18	Growth factor
Peniciline-Streptomycine	BioWest	L0022-100
Pre-Separation Filters (70 µm)	Miltenyi	130-095-823
Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32	BD Pharmingen	553142
Trypsin-EDTA	GIBCO	25300062
2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction
3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]	Sigma	I5879	Differentiation cocktail
BMP4	R&D Systems	5020-BP-010	Differentiation cocktail
Dexamethasone	Sigma	D1756	Differentiation cocktail
Insulin	Sigma	I9278
Rosiglitazone	Cayman	71742	Differentiation cocktail
TNFα	R&D Systems	210-TA-005
3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot
Anti-beta tubulin antibody	Abcam	ab6046
Bromophenol blue	BioRad	161-0404	Laemmli buffer
EDTA	Sigma	E5134	RIPA buffer
EGTA	Sigma	E4378	RIPA buffer
FluorChem E system	ProteinSimple
Glycerol	Sigma	G6279	Laemmli buffer
Glycine	Sigma	G7126	Running and Transfer buffer
Igepal	Sigma	I3021	RIPA buffer
2- mercaptoethanol	Sigma	M3148	Laemmli buffer
Methanol	JT Baker	907007	Transfer buffer
NaCl	JT Baker	3624-05	TBS-T
NaF	Sigma	77F-0379	RIPA buffer
NaOH	JT Baker	3722-19
Na4P2O7	Sigma	114F-0762	RIPA buffer
Na3VO4	Sigma	S6508	RIPA buffer
Nitrocellulose membrane	BioRad	1620112
Nonfat dry milk	BioRad	1706404	Blocking solution
Prestained protein standard	BioRad	1610395
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340-5ML
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-035-132
Phospho- Insulin Receptor β	Cell signaling	3024
Phospho-Akt (Ser473) Antibody	Cell signaling	9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody	Millipore	9432
Saccharose	JT Baker	407205	RIPA buffer
SDS	BioRad	1610302	Running and laemmli buffer
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34577
Tris-base	Promega	H5135	Running, transfer and laemmli buffer
Tris-HCl	JT Baker	4103-02	RIPA buffer – TBS
Tween 20	Sigma	P1379	TBS-T