אדיפוציטים מובחנים של עכברים בתרבית ראשונית: מודל של תנגודת לאינסולין
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של קדם-אדיפוציטים של עכברים משומן תת-עורי, התמיינותם לאדיפוציטים בוגרים והשראת תנגודת לאינסולין. פעולת האינסולין מוערכת על ידי זרחון / הפעלה של חברי מסלול איתות האינסולין דרך כתם מערבי. שיטה זו מאפשרת קביעה ישירה של תנגודת/רגישות לאינסולין באדיפוציטים ראשוניים.
Abstract
תנגודת לאינסולין היא השפעה מופחתת של אינסולין על תאי המטרה שלו, שמקורה בדרך כלל בירידה באיתות קולטני האינסולין. תנגודת לאינסולין תורמת להתפתחות סוכרת מסוג 2 (T2D) ומחלות אחרות הנובעות מהשמנת יתר בשכיחות גבוהה ברחבי העולם. לכן, הבנת המנגנונים העומדים בבסיס התנגודת לאינסולין היא רלוונטית מאוד. מספר מודלים שימשו לחקר עמידות לאינסולין הן in vivo והן in vitro; אדיפוציטים ראשוניים מייצגים אפשרות אטרקטיבית לחקור את מנגנוני התנגודת לאינסולין ולזהות מולקולות המנטרלות מצב זה ואת המטרות המולקולריות של תרופות רגישות לאינסולין. כאן, ביססנו מודל עמידות לאינסולין באמצעות אדיפוציטים ראשוניים בתרבית המטופלים בגורם נמק גידולי α (TNF-α).
תאים מבשרי אדיפוציט (APCs), שבודדו מרקמת שומן תת-עורית של עכבר המעוכל בקולגנאז על ידי טכנולוגיית הפרדת תאים מגנטית, מתמיינים לאדיפוציטים ראשוניים. לאחר מכן נגרמת תנגודת לאינסולין על ידי טיפול ב-TNF-α, ציטוקין מעודד דלקת המפחית את הזרחון/הפעלה של טירוזין של חברי מפל איתות האינסולין. ירידה בזרחון של קולטן אינסולין (IR), מצע קולטן אינסולין (IRS-1) וחלבון קינאז B (AKT) מכומתים על ידי כתם מערבי. שיטה זו מספקת כלי מצוין לחקר המנגנונים המתווכים תנגודת לאינסולין ברקמת השומן.
Introduction
אינסולין הוא הורמון אנבולי המיוצר על ידי תאי β של איון הלבלב והרגולטור העיקרי של מטבוליזם של גלוקוז ושומנים. בין תפקידיו הרבים, אינסולין מווסת את ספיגת הגלוקוז, סינתזת גליקוגן, גלוקונאוגנזה, סינתזת חלבונים, ליפוגנזיסוליפוליזה 1. האות המולקולרי הראשוני לאחר אינטראקציה של אינסולין עם הקולטן שלו (IR) הוא הפעלת הפעילות הפנימית של חלבון טירוזין קינאז של IR2, וכתוצאה מכך אוטופוספורילציה3 שלו והפעלה לאחר מכן של משפחה של חלבונים הידועים בשם מצעי קולטן אינסולין (IRS), אשר נקשר חלבונים מתאמים המוביל להפעלת מפל של קינאזות חלבון4 . אינסולין מפעיל שני מסלולי איתות עיקריים: פוספטידילינוזיטול 3-קינאז (PI3K)-חלבון קינאז B (AKT) וחלבון קינאז המופעל על ידי ראס-מיטוגן (MAPK). הראשון מהווה נקודת הסתעפות או צומת4,5 עיקריים להפעלת גורמים רבים במורד הזרם המעורבים בתפקודים פיזיולוגיים מגוונים, כולל ויסות הומאוסטזיס דלק, ואילו האחרון מווסת את גדילת התאים והתמיינותם 4,6. פעולות אינסולין תלויות בסופו של דבר בסוג התא ובהקשר הפיזיולוגי7.
אחת הרקמות המטבוליות העיקריות המגיבות לאינסולין היא רקמת השומן. רקמת השומן הלבן היא סוג השומן הנפוץ ביותר בבני אדם ובמכרסמים, המופץ בתוך שומן תת עורי (בין העור לשרירים) ושומן ויסצרלי (סביב האיברים בחלל הבטן). בהתחשב בנפח הגדול שלהם, אדיפוציטים או תאי שומן הם סוג התא הנפוץ ביותר ברקמת השומן. תאי שומן אלה יכולים להיות חומים/בז’ (תרמוגניים), ורודים (בבלוטת החלב) ולבנים 8,9. אדיפוציטים לבנים שומרים על עתודות האנרגיה העיקריות בגוף בצורה של טריגליצרידים, תהליך תלוי אינסולין. אינסולין מקדם הובלת גלוקוז וליפוגנזיס, בעוד שהוא מעכב ליפוליזה או פירוק שומנים 7,10. זה גם מקל על התמיינות של preadipocytes לתוך אדיפוציטים – תאים בוגרים אוגרים שומן11.
תנגודת לאינסולין מתרחשת כאשר רמת אינסולין נורמלית מייצרת תגובה ביולוגית מוחלשת, וכתוצאה מכך היפראינסולינמיה מפצה12. עמידות לאינסולין היא מצב הקשור לעודף משקל והשמנת יתר5, שבשילוב מוביל לסוכרת מסוג 2 (T2D) ומחלות מטבוליות אחרות13. היפראינסולינמיה מפצה תנגודת לאינסולין ברקמות היקפיות כדי לשמור על רמות גלוקוז תקינותבדם 14. עם זאת, אובדן או תשישות של תאי β בסופו של דבר, יחד עם עמידות מחמירה לאינסולין, מובילים לרמות גלוקוז גבוהות בדם התואמות לסוכרת סוג2 5. לכן, עמידות לאינסולין והיפראינסולינמיה יכולות לתרום להתפתחות מחלות מטבוליות הנגזרות מהשמנת יתר15. יתר על כן, השמנת יתר עלולה לגרום לדלקת מקומית כרונית בדרגה נמוכה המקדמת עמידות לאינסולין ברקמת השומן15,16,17. בנוסף, שינויים שמקורם בהשמנת יתר ברקמת השומן, כגון פיברוזיס, דלקת ואנגיוגנזה מופחתת ואדיפוגנזה, מובילים לרמות נמוכות יותר בסרום האדיפונקטין (רגיש לאינסולין) ולהפרשת גורמים כגון מעכב מפעיל פלסמינוגן 1 (PAI-1), חומצות שומן חופשיות ואקסוזומים לזרם הדם, המחריפים את התנגודת לאינסולין17.
היבטים רבים העומדים בבסיס התנגודת לאינסולין עדיין אינם ידועים. מודלים In vitro ו-in vivo פותחו כדי לחקור את המנגנונים המתווכים עמידות לאינסולין ברקמות מטרה עיקריות, כולל רקמת שומן. היתרון של מודלים במבחנה הוא שלחוקרים יש שליטה רבה יותר על תנאי הסביבה והם יכולים להעריך עמידות לאינסולין בסוגי תאים ספציפיים. בפרט, לתאים מבשרי אדיפוציט (APCs) יש את הפנוטיפ האינדיבידואלי של הרקמה התורמת, אשר עשוי לשקף פיזיולוגיה טוב יותר מאשר קווי תאי אדיפוציט. גורם עיקרי הגורם לתנגודת לאינסולין במבחנה הוא גורם נמק גידולי α (TNF-α). TNF-α הוא ציטוקין מעודד דלקת המופרש על ידי אדיפוציטים ומקרופאגים ברקמת השומן18. בעוד שהוא נדרש לשיפוץ והרחבה תקינים של רקמת השומן19, חשיפה ארוכת טווח ל-TNF-α גורמת לתנגודת לאינסולין ברקמת השומן in vivo ובאדיפוציטים במבחנה20. טיפול כרוני ב-TNF-α במספר סוגי תאים מוביל לזרחן סרין מוגבר הן של IR והן של IRS-1, ובכך מקדם ירידה בזרחון טירוזין21. זרחן מוגבר של IRS-1 על שאריות סרין מעכב את פעילות IR טירוזין קינאז ועשוי להיות אחד המנגנונים העיקריים שבאמצעותם טיפול כרוני ב- TNF-α פוגע בפעולת האינסולין22,23. TNF-α מפעיל מסלולים המערבים מעכב סרין/תראונין קינאז של גורם גרעיני ĸB קינאז β (IKKβ) ו-c-Jun N terminal kinase (JNK)24. JNK משרה תוכנית שעתוק פרו-דלקתית מורכבת אך גם זרחן ישיר IRS-16.
הבנת הפתוגנזה של תנגודת לאינסולין הפכה חשובה יותר ויותר כדי להנחות את הפיתוח של טיפולים עתידיים נגד סוכרת סוג 2. נגמ”שים הוכיחו את עצמם כמודל מצוין לחקר הביולוגיה של תאי השומן, כולל הרגישות והעמידות לאינסולין, ולזיהוי התכונות הפנימיות של אדיפוציטים ללא תלות בסביבה המערכתית. נגמ”שים ניתן להשיג בקלות ממחסני שומן שונים, ובתנאים המתאימים, להתמיין לאדיפוציטים בוגרים. בשיטה זו ניתן להעריך השפעות ישירות על התנגודות/רגישות לאינסולין באדיפוציטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מספק שיטה לחקר עמידות לאינסולין המשתמשת באדיפוציטים ראשוניים בתרבית המטופלת ב-TNF-α. למודל זה יש יתרון בכך שניתן לגדל בתרבית אדיפוציטים ראשוניים בתנאים מוגדרים לפרקי זמן ארוכים עם בקרה הדוקה של גורמים סביבתיים תאיים26. משך הבדיקה הוא 15-20 ימים, אם כי שינויים באחוז האדיפו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לדניאל מונדרגון, אנטוניו פראדו, פרננדו לופז-בררה, מרטין גרסיה-סרבין, אלחנדרה קסטילה ומריה אנטונייטה קרבאג’ו על עזרתם הטכנית, ולג’סיקה גונזלס נוריס על העריכה הביקורתית של כתב היד. פרוטוקול זה נתמך על ידי Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (ל- Y.M).
Materials
| 1. Isolation mouse adipocyte precursor cells | |||
| ACK lysing buffer | LONZA | 10-548E | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi | 130-090-485 | |
| Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | ||
| Basement membrane matrix (matrigel) | Corning | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | Growth factor |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) – Biotin | eBioscience | 13-0451-85 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochem | LS004197 | |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM low glucose | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Growth factor |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| ITS mix | Sigma | I3146 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Growth factor |
| Linoleic acid-albumin | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 medium | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | Growth factor |
| Peniciline-Streptomycine | BioWest | L0022-100 | |
| Pre-Separation Filters (70 µm) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| 2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction | |||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] | Sigma | I5879 | Differentiation cocktail |
| BMP4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | Differentiation cocktail |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Differentiation cocktail |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71742 | Differentiation cocktail |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-005 | |
| 3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot | |||
| Anti-beta tubulin antibody | Abcam | ab6046 | |
| Bromophenol blue | BioRad | 161-0404 | Laemmli buffer |
| EDTA | Sigma | E5134 | RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E4378 | RIPA buffer |
| FluorChem E system | ProteinSimple | ||
| Glycerol | Sigma | G6279 | Laemmli buffer |
| Glycine | Sigma | G7126 | Running and Transfer buffer |
| Igepal | Sigma | I3021 | RIPA buffer |
| 2- mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Laemmli buffer |
| Methanol | JT Baker | 907007 | Transfer buffer |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | Sigma | 77F-0379 | RIPA buffer |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA buffer |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | RIPA buffer |
| Nitrocellulose membrane | BioRad | 1620112 | |
| Nonfat dry milk | BioRad | 1706404 | Blocking solution |
| Prestained protein standard | BioRad | 1610395 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-5ML | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
| Phospho- Insulin Receptor β | Cell signaling | 3024 | |
| Phospho-Akt (Ser473) Antibody | Cell signaling | 9271 | |
| Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody | Millipore | 9432 | |
| Saccharose | JT Baker | 407205 | RIPA buffer |
| SDS | BioRad | 1610302 | Running and laemmli buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| Tris-base | Promega | H5135 | Running, transfer and laemmli buffer |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA buffer – TBS |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |
References
- Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
- Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).
- Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor. Science. 215 (4529), 185-187 (1982).
- Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).
- Insulin Resistance. StatPearls Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/ (2021)
- Petersen, M. C., Shulm, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
- Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes. Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).
- Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , 370-384 (2019).
- Cinti, S. Pink adipocytes. Trends in Endocrinology & Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).
- Kahn, B. B., Flier, J. S. Obesity and insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).
- Klemm, D. J., et al. Insulin-induced adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).
- Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).
- Yohannes, T. W. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).
- James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. The etiology and molecular landscape of insulin resistance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).
- Wondmkun, Y. T. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).
- Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. What causes the insulin resistance underlying obesity. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).
- Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. Why does obesity cause diabetes. Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).
- Lo, K., et al. Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance. Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).
- Asterholm, I. W., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191 (2014).
- Hotamisligil, G. S., et al. IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance. Science. 271 (5249), 665-668 (1996).
- Copps, K. D., White, M. F. Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2. Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Skurk, T., Hauner, H. Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation. Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. The biology of white adipocyte proliferation. Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).
- Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD. Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).
- Guo, W., et al. Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects. The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).
- Isidor, M. S., et al. Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes. International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
