Differentierade musadipocyter i primärkultur: En modell av insulinresistens
Summary
Detta protokoll beskriver isoleringen av muspreadipocyter från subkutant fett, deras differentiering till mogna adipocyter och induktion av insulinresistens. Insulinverkan utvärderas genom fosforylering/aktivering av medlemmar av insulinsignalvägen genom western blot. Denna metod möjliggör direkt bestämning av insulinresistens/känslighet i primära adipocyter.
Abstract
Insulinresistens är en minskad effekt av insulin på dess målceller, vanligtvis härledd från minskad insulinreceptorsignalering. Insulinresistens bidrar till utvecklingen av typ 2-diabetes (T2D) och andra fetma-härledda sjukdomar med hög prevalens över hela världen. Därför är det av stor betydelse att förstå mekanismerna bakom insulinresistens. Flera modeller har använts för att studera insulinresistens både in vivo och in vitro; Primära adipocyter representerar ett attraktivt alternativ för att studera mekanismerna för insulinresistens och identifiera molekyler som motverkar detta tillstånd och de molekylära målen för insulinsensibiliserande läkemedel. Här har vi etablerat en insulinresistensmodell med hjälp av primära adipocyter i odling behandlade med tumörnekrosfaktor-α (TNF-α).
Adipocytprekursorceller (APC), isolerade från kollagenas-smält mus subkutan fettvävnad genom magnetisk cellseparationsteknik, differentieras till primära adipocyter. Insulinresistens induceras sedan genom behandling med TNF-α, ett proinflammatoriskt cytokin som minskar tyrosinfosforyleringen/aktiveringen av medlemmar i insulinsignalkaskaden. Minskad fosforylering av insulinreceptor (IR), insulinreceptorsubstrat (IRS-1) och proteinkinas B (AKT) kvantifieras av western blot. Denna metod ger ett utmärkt verktyg för att studera mekanismerna som förmedlar insulinresistens i fettvävnad.
Introduction
Insulin är ett anabolt hormon som produceras av pankreas ö-β-celler och den viktigaste regulatorn för glukos och lipidmetabolism. Bland dess många funktioner reglerar insulin glukosupptag, glykogensyntes, glukoneogenes, proteinsyntes, lipogenes och lipolys1. Den initiala molekylära signalen efter insulininteraktion med dess receptor (IR) är aktiveringen av den inneboende tyrosinkinskinasaktiviteten hos IR2, vilket resulterar i dess autofosforylering3 och efterföljande aktivering av en familj av proteiner som kallas insulinreceptorsubstrat (IRS), som binder till adaptorproteiner vilket leder till aktivering av en kaskad av proteinkinaser4 . Insulin aktiverar två huvudsakliga signalvägar: fosfatidylinositol-3-kinas (PI3K)-proteinkinas B (AKT) och Ras-mitogenaktiverat proteinkinas (MAPK). Den förstnämnda utgör en viktig grenpunkt eller nod 4,5 för aktivering av många nedströmseffektorer som är involverade i olika fysiologiska funktioner, inklusive reglering av bränslehomeostas, medan den senare reglerar celltillväxt och differentiering 4,6. Insulinåtgärder beror i slutändan på celltyp och fysiologiskt sammanhang7.
En av de viktigaste insulinresponsiva metaboliska vävnaderna är fettvävnaden. Vit fettvävnad är den vanligaste typen av fett hos människor och gnagare, fördelat inom subkutant fett (mellan hud och muskler) och visceralt fett (runt organen i bukhålan). Med tanke på deras stora volym är adipocyter eller fettceller den vanligaste celltypen i fettvävnad. Dessa fettceller kan vara bruna/beige (termogena), rosa (i bröstkörteln) och vita 8,9. Vita adipocyter håller de viktigaste energireserverna i kroppen i form av triglycerider, en insulinberoende process. Insulin främjar glukostransport och lipogenes, medan det hämmar lipolys eller lipidnedbrytning 7,10. Det underlättar också differentieringen av preadipocyter till adipocyter – de mogna fettlagrande cellerna11.
Insulinresistens uppstår när en normal insulinnivå ger ett försvagat biologiskt svar, vilket resulterar i kompensatorisk hyperinsulinemi12. Insulinresistens är ett tillstånd som är förknippat med övervikt och fetma5, som i kombination leder till typ 2-diabetes (T2D) och andra metabola sjukdomar13. Hyperinsulinemi kompenserar insulinresistens i perifera vävnader för att upprätthålla normala blodsockernivåer14. Emellertid leder eventuell β-cellförlust eller utmattning, tillsammans med förvärrad insulinresistens, till förhöjda blodsockernivåer som överensstämmer med T2D5. Därför kan insulinresistens och hyperinsulinemi bidra till utvecklingen av fetma-härledda metaboliska sjukdomar15. Dessutom kan fetma orsaka kronisk låggradig lokal inflammation som främjar insulinresistens i fettvävnad15,16,17. Dessutom leder fetma-härledda förändringar i fettvävnad, såsom fibros, inflammation och minskad angiogenes och adipogenesis, till lägre adiponektinserumnivåer (en insulinsensibiliserare) och ökad utsöndring av faktorer såsom plasminogenaktivatorhämmare 1 (PAI-1), fria fettsyror och exosomer i blodomloppet, vilket förvärrar insulinresistens17.
Många aspekter som ligger bakom insulinresistens är fortfarande okända. In vitro– och in vivo-modeller har utvecklats för att studera mekanismerna som medierar insulinresistens i större målvävnader, inklusive fettvävnad. Fördelen med in vitro-modeller är att forskare har mer kontroll över miljöförhållandena och kan utvärdera insulinresistens i specifika celltyper. Särskilt, adipocytprekursorceller (APC) har den individuella fenotypen av givarvävnaden, vilket kan återspegla fysiologi bättre än adipocytcellinjer. En huvudfaktor som inducerar insulinresistens in vitro är tumörnekrosfaktor-α (TNF-α). TNF-α är ett proinflammatoriskt cytokin som utsöndras av adipocyter och makrofager i fettvävnad18. Även om det krävs för korrekt ombyggnad och expansion av fettvävnad19, inducerar långvarig exponering för TNF-α insulinresistens i fettvävnad in vivo och i adipocyter in vitro20. Kronisk TNF-α behandling av flera celltyper leder till ökad serinfosforylering av både IR och IRS-1, vilket främjar minskad tyrosinfosforylering21. Ökad fosforylering av IRS-1 på serinrester hämmar IR-tyrosinkinasaktiviteten och kan vara en av de viktigaste mekanismerna genom vilka kronisk TNF-α behandling försämrar insulinverkan22,23. TNF-α aktiverar vägar som involverar serin/treoninkinashämmaren av kärnfaktorn ĸB-kinas β (IKKβ) och c-Jun N-terminalkinas (JNK)24. JNK inducerar ett komplext proinflammatoriskt transkriptionsprogram men fosforylerar också IRS-16 direkt.
Att förstå patogenesen av insulinresistens har blivit allt viktigare för att styra utvecklingen av framtida terapier mot T2D. APC har visat sig vara en utmärkt modell för studier av fettcellsbiologi, inklusive känslighet och resistens mot insulin, och för att identifiera de inneboende egenskaperna hos adipocyter oberoende av den systemiska miljön. APC kan lätt erhållas från olika fettdepåer och under lämpliga förhållanden differentieras till mogna adipocyter. Med denna metod kan direkta effekter på insulinresistens/känslighet utvärderas i adipocyter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta dokument ger en metod för att studera insulinresistens som använder primära adipocyter i odling behandlad med TNF-α. Denna modell har fördelen att primära adipocyter kan odlas under definierade förhållanden under långa tidsperioder med en tät kontroll av cellulära miljöfaktorer26. Analystiden är 15-20 dagar, även om variationer i andelen differentierade adipocyter kan förekomma mellan experiment. Primära adipocyter har fördelar jämfört med cellinjer eftersom de inte kontin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla och María Antonieta Carbajo för deras tekniska hjälp, och Jessica Gonzalez Norris för kritisk redigering av manuskriptet. Detta protokoll stöddes av Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (till Y.M.).
Materials
| 1. Isolation mouse adipocyte precursor cells | |||
| ACK lysing buffer | LONZA | 10-548E | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi | 130-090-485 | |
| Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | ||
| Basement membrane matrix (matrigel) | Corning | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | Growth factor |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) – Biotin | eBioscience | 13-0451-85 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochem | LS004197 | |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM low glucose | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Growth factor |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| ITS mix | Sigma | I3146 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Growth factor |
| Linoleic acid-albumin | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 medium | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | Growth factor |
| Peniciline-Streptomycine | BioWest | L0022-100 | |
| Pre-Separation Filters (70 µm) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| 2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction | |||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] | Sigma | I5879 | Differentiation cocktail |
| BMP4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | Differentiation cocktail |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Differentiation cocktail |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71742 | Differentiation cocktail |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-005 | |
| 3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot | |||
| Anti-beta tubulin antibody | Abcam | ab6046 | |
| Bromophenol blue | BioRad | 161-0404 | Laemmli buffer |
| EDTA | Sigma | E5134 | RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E4378 | RIPA buffer |
| FluorChem E system | ProteinSimple | ||
| Glycerol | Sigma | G6279 | Laemmli buffer |
| Glycine | Sigma | G7126 | Running and Transfer buffer |
| Igepal | Sigma | I3021 | RIPA buffer |
| 2- mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Laemmli buffer |
| Methanol | JT Baker | 907007 | Transfer buffer |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | Sigma | 77F-0379 | RIPA buffer |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA buffer |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | RIPA buffer |
| Nitrocellulose membrane | BioRad | 1620112 | |
| Nonfat dry milk | BioRad | 1706404 | Blocking solution |
| Prestained protein standard | BioRad | 1610395 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-5ML | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
| Phospho- Insulin Receptor β | Cell signaling | 3024 | |
| Phospho-Akt (Ser473) Antibody | Cell signaling | 9271 | |
| Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody | Millipore | 9432 | |
| Saccharose | JT Baker | 407205 | RIPA buffer |
| SDS | BioRad | 1610302 | Running and laemmli buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| Tris-base | Promega | H5135 | Running, transfer and laemmli buffer |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA buffer – TBS |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |
References
- Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
- Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).
- Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor. Science. 215 (4529), 185-187 (1982).
- Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).
- Insulin Resistance. StatPearls Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/ (2021)
- Petersen, M. C., Shulm, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
- Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes. Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).
- Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , 370-384 (2019).
- Cinti, S. Pink adipocytes. Trends in Endocrinology & Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).
- Kahn, B. B., Flier, J. S. Obesity and insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).
- Klemm, D. J., et al. Insulin-induced adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).
- Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).
- Yohannes, T. W. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).
- James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. The etiology and molecular landscape of insulin resistance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).
- Wondmkun, Y. T. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).
- Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. What causes the insulin resistance underlying obesity. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).
- Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. Why does obesity cause diabetes. Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).
- Lo, K., et al. Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance. Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).
- Asterholm, I. W., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191 (2014).
- Hotamisligil, G. S., et al. IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance. Science. 271 (5249), 665-668 (1996).
- Copps, K. D., White, M. F. Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2. Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Skurk, T., Hauner, H. Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation. Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. The biology of white adipocyte proliferation. Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).
- Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD. Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).
- Guo, W., et al. Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects. The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).
- Isidor, M. S., et al. Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes. International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
