Entrenamiento de resistencia ajustado a la dosis en ratones con un riesgo reducido de daño muscular
Summary
El presente protocolo describe una técnica única llamada entrenamiento de resistencia ajustado por dosis (DART), que puede incorporarse a estudios de rehabilitación de precisión realizados en animales pequeños, como ratones.
Abstract
El entrenamiento de resistencia progresiva (PRT), que implica realizar contracciones musculares contra cargas externas progresivamente mayores, puede aumentar la masa muscular y la fuerza en individuos sanos y en poblaciones de pacientes. Se necesitan herramientas de rehabilitación de precisión para probar la seguridad y eficacia de PRT para mantener y / o restaurar la masa muscular y la fuerza en estudios preclínicos en modelos animales pequeños y grandes. La metodología y el dispositivo PRT descritos en este artículo se pueden usar para realizar entrenamiento de resistencia ajustado por dosis (DART). El dispositivo DART se puede utilizar como un dinamómetro independiente para evaluar objetivamente el par contráctil concéntrico generado por los dorsiflexores del tobillo en ratones o se puede agregar a un sistema de dinamometría isocinética preexistente. El dispositivo DART se puede fabricar con una impresora 3D estándar basada en las instrucciones y los archivos de impresión 3D de código abierto proporcionados en este trabajo. El artículo también describe el flujo de trabajo de un estudio para comparar el daño muscular inducido por la contracción causado por un solo ataque de DART con el daño muscular causado por un episodio comparable de contracciones isométricas (ISOM) en un modelo de ratón de distrofia muscular de cinturas tipo 2B / R2 (ratones BLAZ). Los datos de ocho ratones BLAJ (cuatro animales para cada condición) sugieren que menos del 10% del músculo tibial anterior (TA) se dañó por un solo ataque de DART o ISOM, siendo DART menos dañino que ISOM.
Introduction
El ejercicio confiere numerosos beneficios para la salud en el músculo esquelético (revisado en Vina et al.1). Específicamente, se sabe que el entrenamiento de resistencia progresiva (PRT), que consiste en realizar contracciones musculares contra cargas externas progresivamente mayores (por ejemplo, barras, mancuernas, circuitos de cable-polea-peso), ayuda a aumentar la masa muscular y la fuerza tanto en individuos sanos como en poblaciones de pacientes (revisado en publicaciones anteriores 2,3 ). La TRP se basa en el principio de sobrecarga, que establece que, cuando el músculo se contrae contra cargas externas progresivamente mayores, se adapta aumentando su área de sección transversal fisiológica, así como la capacidad de producción de fuerza4. Los modelos existentes de PRT en roedores incluyen subir escaleras con resistencia aplicada a la cola, co-contracción de los músculos agonistas contra la resistencia de los antagonistas, correr con un arnés pesado, un ejercicio de sentadilla provocado por una descarga eléctrica y resistir la carrera de la rueda 5,6,7,8,9,10 (revisado en publicaciones anteriores 11,12 ). Sin embargo, actualmente no existen herramientas de investigación para realizar PRT precisamente dirigida al músculo y ajustada a la dosis en ratones que se asemejen mucho a los métodos y dispositivos PRT utilizados en la investigación clínica humana y la práctica12,13. Esto limita la capacidad de los investigadores para estudiar la seguridad y eficacia de la PRT dosificada con precisión en estudios básicos y preclínicos en ratones.
Para superar esta barrera, en este estudio se desarrolla una metodología y un dispositivo PRT basados en los diseños de circuitos de cable-polea-peso empleados en equipos de entrenamiento de resistencia en gimnasios modernos14,15,16. Este método de PRT se conoce como entrenamiento de resistencia ajustado por dosis (DART), y el dispositivo se llama dispositivo DART. Además de su funcionalidad como herramienta de entrenamiento de rehabilitación de precisión, el dispositivo DART también se puede utilizar como un instrumento independiente para evaluar objetivamente el par contráctil concéntrico máximo que puede ser generado por el músculo tibial anterior (TA) en un ratón, similar a cómo se evalúa el máximo de una repetición (1RM, la carga máxima que se puede levantar / mover / presionar / poner en cuclillas con éxito solo una vez mientras se mantiene una buena forma) en humanos17, 18. El dispositivo DART también se puede acoplar con un dinamómetro isocinético personalizado o comercial para medir la fuerza tetánica isométrica máxima producida por el músculo TA en un ratón (comparable a la contracción voluntaria máxima [MVC] en humanos) y luego realizar PRT ajustada a la dosis con una resistencia que se basa en la fuerza tetánica máxima (por ejemplo, 50% de la fuerza máxima).
Este artículo describe la construcción del dispositivo DART y explica cómo se puede acoplar con un dinamómetro personalizado, que se ha descrito en publicaciones anteriores 19,20,21,22, para evaluar el par contráctil y realizar DART. El estudio también describe cómo se utilizó el dispositivo DART para comparar el daño muscular inducido por el ejercicio causado por un solo episodio de DART (4 series de 10 contracciones concéntricamente sesgadas con 50% de 1RM) con el daño causado por un episodio comparable de contracciones isométricas (4 series de 10 contracciones isométricas) en un modelo de ratón de distrofia muscular de cinturas tipo 2B (LGMD2B, o LGMDR2)23,24. El modelo de ratón que se estudió carece de una proteína llamada disferlina, que desempeña un papel importante en la protección del músculo esquelético contra el daño muscular de aparición tardía después de contracciones excéntricas perjudiciales 22,25,26,27,28,29,30 . También se ha demostrado en ratones machos deficientes en disferina que el ejercicio forzado concéntricamente sesgado no es tan dañino como el ejercicio forzado excéntricamente sesgado y que la exposición previa al entrenamiento concéntricamente sesgado ofrece protección contra lesiones de un episodio posterior de contracciones excéntricamente sesgadas22. Dado que el estudio actual se realizó para probar la viabilidad de la metodología y el dispositivo DART actuales para realizar entrenamiento de resistencia ajustado por dosis y sesgado concéntricamente, se eligieron ratones machos deficientes en disferlina para la investigación para comparar nuevos datos del dispositivo DART con datos anteriores. En futuros estudios, se incluirán ratones BLAJ hembra para estudiar el efecto del sexo como variable biológica en relación con la respuesta a DART. Se estudiaron ratones que tenían ~ 1,5 años de edad, ya que ya tienen cambios distróficos en muchos grupos musculares y, por lo tanto, modelan el estado fisiopatológico en el que podrían estar los músculos en pacientes que ya tienen debilidad muscular y desgaste y están buscando atención de rehabilitación para mantener la masa muscular y la fuerza26.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo presenta instrucciones paso a paso sobre cómo construir un dispositivo para realizar un tipo de entrenamiento de rehabilitación de precisión llamado entrenamiento de resistencia ajustado por dosis (DART). El trabajo también describe la aplicación del dispositivo y la metodología DART en un estudio de entrenamiento para comparar el daño muscular 3 días después de un solo episodio de DART (grupo DART) con el daño 3 días después de un episodio comparable de entrenamiento isométrico (grupo ISOM).<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue financiado por subvenciones de Jain Foundation Inc., R03HD091648 del NICHD, una subvención piloto de AR3T bajo NIH P2CHD086843, un premio FRAP de EACPHS en Wayne State University, un paquete de inicio de la facultad de Wayne State University y un subcontrato de 1R01AR079884-01 (Peter L. Jones PI) a JAR. Este estudio también fue financiado por una subvención de investigación de la Asociación Americana de Terapia Física – Michigan (APTA-MI) a JMB, MEP y JAR. Los autores reconocen a la Dra. Renuka Roche (Profesora Asociada, Eastern Michigan University, MI) por leer críticamente el manuscrito y proporcionar comentarios. Los autores agradecen al Sr. Anselm D. Motha por sus consejos sobre impresión 3D. Los autores agradecen a los pacientes con disferlinopatías que han compartido sus historias en el sitio web de la Fundación Jain en https://www.jain-foundation.org/patient-physician-resources/patient-stories, particularmente sus experiencias con el ejercicio.
Materials
| AnMiao Star 608 Ceramic Ball Bearing | Anmiao Star (N/A) | AMS127 | High precision, low friction wheel bearing. If make and model is not commercially available, an alternative version of a 608 low-friction wheel bearing, 8 mm bore diameter, 22 mm outside diameter, with silicon nitride ceramic balls in 420 stainless steel housing should suffice. Excess friction in the wheel bearing will adversely impact performance of the DART device and will increase overall resistance to muscle contractions. |
| Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
| B6.A-Dysfprmd/GeneJ (a.k.a. BLAJ mice) | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Special colony maintained by The Jain Foundation Inc. for collaborators who study dysferlin. | Stock #012767 | Dysferlin deficient mice that model human limb girdle muscular dystrophy type 2B/R2. |
| Bipolar, transcutaneous, neuromuscular electrical stimulation (NMES) electrode | Harvard Apparatus, Holliston, MA | BS4 50–6824 | Electrode for NMES. If this electrode is not commercially available, please contact corresponding author for alternatives. |
| Coplin Staining Dish | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog No. S17495 | Staining dish/jar for hematoxylin and eosin (H&E) staining of sections |
| Cura 4.4.1. Software | Ultimaker, Utrecht, Netherlands | Ultimaker Cura 4.4.1. | Slicing software to convert stereolithography files into G-CODE files |
| Deltaphase isothermal gel heating pad | Braintree Scientific (Braintree, MA) | Item #39DP | Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia |
| Eosin Y | Millipore Sigma (Burlington, MA) | HT110132-1L | Pink cytoplasmic stain |
| Gorilla Super Glue | The Gorilla Glue Company (Cincinnati, OH) | Gorilla Super Glue Micro Precise | Cyanoacrylate adhesive to bond PLA components |
| Hematoxylin solution, Gill No.3 | Millipore Sigma (Burlington, MA) | GHS332-1L | Dark blue stain for nuclei |
| HM525NX cryostat | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog #HM525NX | Cryostat to make frozen sections of muscle |
| Lab Wipes. Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog No. 06-666. Manufacturer #34120 | Laboratory wipes to blot mineral oil from muscle tissue before snap freezing and for other purposes. |
| Labview 2014 | National Instruments, Austin, Texas, USA | Labview 2014 | Software for custom-written programs/routines that operate the dynamometer and trigger the NMES stimulator. |
| Liquid nitrogen HDPE Dewar Flasks | ThermoFisher (Waltham, MA) | S34074B. Thermo Scientific 41502000/EMD | Flask to hold liquid nitrogen for snap freezing muscle or other tissue |
| Magic depilatory cream | Softsheen Carson (New York, NY) | N/A | Razorless hair removal cream |
| Metal alligator clip | JINSHANGTOPK (web-based business) | 24Pcs 51mm Metal Alligator Clip Spring Clamps | Spring clamp to hold tibial pin |
| Micrscope slides | Globe Scientific (Mahwah, NJ) | 1354W. Diamond White Glass Slides | Charged microscope slides |
| Mineral Oil | ThermoFisher (Waltham, MA) | BP26291 | Mineral oil to cryoprotect muscle tissue before snap freezing |
| Monoprice Premium 3D Printer Filament PLA | Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) | #11778 | Premium 3D Printer Filament PLA 1.75mm 1 kg/spool, Gray. This is the material used to 3D print device components. |
| Monoprice Select Mini V2 3D printer | Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) | Mini V2 3D | 3D printer for computer-aided fabrication of device components. |
| NIH Image software | National Instritues of Health (NIH, Bethesda, MD) | NIH Image for Windows | Image processing and analysis software used to quantify area of muscle damage. NIH Image is also known as Image J. |
| Photoshop CS4 | Adobe (San Jose, CA) | Creative Suite (CS4). 64 bit version for Windows | Image processing and analysis software used to generate tiled/stiched images of entire muscle cross-section from images of indvidual overlapping fields |
| PSIU6 stimulation isolation unit | Grass Instruments (West Warwick, RI) | PSIU6 isolation unit | Isolation unit for NMES. Stimulators, such as Model 4100 from A-M come with a built in stimulation isoloation unit |
| Roboz 4-0 silk black braided suture material | Roboz Surgical (Gaithersburg, MD) | Roboz Surgical SUT152 | Suture material to connect DART device footplate to dynamometer footplate or resistance for resistance training |
| S48 square pulse stimulator | Grass Instruments (West Warwick, RI) | S48 Stimulator | Laboratory electrical stimulator for NMES . If this stimulator is not commercially available, Model 4100 Isolated High Power Stimulator from A-M systems could be an alternative. Please contact co-author Jones for more information. |
| Scott’s bluing reagent | Ricca Chemical Company (Arlington, TX) | 6697-32 | Bluing solution that intensifies hematoxylin nuclear staining |
| SigmaStat version 3.5 | Systat Software (San Jose, CA) | SigmaStat version 3.5 | Statistical software package for statistical analyses |
| Tabletop isoflurane vaporizer | VetEquip (Livermore, CA) | Item #901801 | Inhaled tabletop anesthesia system |
| Triple antibiotic first aid ointment | Global Health Products (wed-based business) | Globe Triple Antibiotic First Aid Ointment, 1 oz (2-Pack) First Aid Antibiotic Ointment | Antibiotic ointment applied on tibial pin as part of post-procedural care |
References
- Vina, J., Sanchis-Gomar, F., Martinez-Bello, V., Gomez-Cabrera, M. C. Exercise acts as a drug; The pharmacological benefits of exercise. British Journal of Pharmacology. 167 (1), 1-12 (2012).
- Murton, A. J., Greenhaff, P. L. Resistance exercise and the mechanisms of muscle mass regulation in humans: Acute effects on muscle protein turnover and the gaps in our understanding of chronic resistance exercise training adaptation. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (10), 2209-2214 (2013).
- Pepin, M. E., Roche, J. A., Malek, M. H., Chandler, T. J., Brown, L. E. Strength Training for Special Populations. Conditioning for Strength and Human Performance. , 547-570 (2019).
- Helland, C., et al. Training strategies to improve muscle power: Is Olympic-style weightlifting relevant. Medicine and Science in Sports and Exercise. 49 (4), 736-745 (2017).
- Souza, M. K., et al. l-Arginine supplementation blunts resistance exercise improvement in rats with chronic kidney disease. Life Sciences. 232, 116604 (2019).
- Schmoll, M., et al. SpillOver stimulation: A novel hypertrophy model using co-contraction of the plantar-flexors to load the tibial anterior muscle in rats. PloS One. 13 (11), 0207886 (2018).
- Adams, G. R., Haddad, F., Bodell, P. W., Tran, P. D., Baldwin, K. M. Combined isometric, concentric, and eccentric resistance exercise prevents unloading-induced muscle atrophy in rats. Journal of Applied Physiology. 103 (5), 1644-1654 (2007).
- Guedes, J. M., et al. Muscular resistance, hypertrophy and strength training equally reduce adiposity, inflammation and insulin resistance in mice with diet-induced obesity. Einstein. 18, (2019).
- Zhu, W. G., et al. Weight pulling: A novel mouse model of human progressive resistance exercise. Cells. 10 (9), 2459 (2021).
- Call, J. A., McKeehen, J. N., Novotny, S. A., Lowe, D. A. Progressive resistance voluntary wheel running in the mdx mouse. Muscle & Nerve. 42 (6), 871-880 (2010).
- Strickland, J. C., Smith, M. A. Animal models of resistance exercise and their application to neuroscience research. Journal of Neuroscience Methods. 273, 191-200 (2016).
- Greising, S. M., Basten, A. M., Schifino, A. G., Call, J. A., Greising, S. M., Call, J. A. Considerations for Small Animal Physical Rehabilitation. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. , 39-59 (2022).
- Roche, J. A., Greising, S. M., Call, J. A. Regenerative Rehabilitation for Nonlethal Muscular Dystrophies. Regenerative Rehabilitation: From Basic Science to the Clinic. , 61-84 (2022).
- Schott, N., Johnen, B., Holfelder, B. Effects of free weights and machine training on muscular strength in high-functioning older adults. Experimental Gerontology. 122, 15-24 (2019).
- . Dr. Gustav Zander’s Victorian-Era Exercise Machines Made the Bowflex Look Like Child’s Play Available from: https://www.smithsonianmag.com/smithsonian-institution/gustav-zander-victorian-era-exercise-machines-bowflex-180957758/ (2016)
- Hansson, N., Ottosson, A. Nobel prize for physical therapy? Rise, fall, and revival of medico-mechanical institutes. Physical Therapy. 95 (8), 1184-1194 (2015).
- ACSM. American College of Sports Medicine position stand. Progression models in resistance training for healthy adults. Medicine and Science in Sports and Exercise. 41 (3), 687-708 (2009).
- Suchomel, T. J., Nimphius, S., Bellon, C. R., Hornsby, W. G., Stone, M. H. Training for muscular strength: Methods for monitoring and adjusting training intensity. Sports Medicine. 51 (10), 2051-2066 (2021).
- Bloch, R. J., et al. Small-Animal Unit for Muscle Injury, Muscle Testing and Muscle Training in Vivo. US Patent. , (2012).
- Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., McMillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e2782 (2011).
- Begam, M., et al. Diltiazem improves contractile properties of skeletal muscle in dysferlin-deficient BLAJ mice, but does not reduce contraction-induced muscle damage. Physiological Reports. 6 (11), 13727 (2018).
- Begam, M., et al. The effects of concentric and eccentric training in murine models of dysferlin-associated muscular dystrophy. Muscle and Nerve. 62 (3), 393-403 (2020).
- Straub, V., Murphy, A., Udd, B. 229th ENMC international workshop: Limb girdle muscular dystrophies – Nomenclature and reformed classification Naarden, the Netherlands. Neuromuscular Disorders. 28 (8), 702-710 (2018).
- . DYSFERLIN Available from: https://www.omim.org/entry/603009 (2021)
- Millay, D. P., et al. Genetic manipulation of dysferlin expression in skeletal muscle: Novel insights into muscular dystrophy. American Journal of Pathology. 175 (5), 1817-1823 (2009).
- Nagy, N., et al. Hip region muscular dystrophy and emergence of motor deficits in dysferlin-deficient Bla/J mice. Physiological Reports. 5 (6), 13173 (2017).
- Roche, J. A., Lovering, R. M., Bloch, R. J. Impaired recovery of dysferlin-null skeletal muscle after contraction-induced injury in vivo. Neuroreport. 19 (16), 1579-1584 (2008).
- Roche, J. A., et al. Extensive mononuclear infiltration and myogenesis characterize recovery of dysferlin-null skeletal muscle from contraction-induced injuries. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 298 (2), 298-312 (2010).
- Roche, J. A., Ru, L. W., Bloch, R. J. Distinct effects of contraction-induced injury in vivo on four different murine models of dysferlinopathy. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 134031 (2012).
- Roche, J. A., et al. Myofiber damage precedes macrophage infiltration after in vivo injury in dysferlin-deficient A/J mouse skeletal muscle. American Journal of Pathology. 185 (6), 1686-1698 (2015).
- Ingalls, C. P., Warren, G. L., Zhang, J. Z., Hamilton, S. L., Armstrong, R. B. Dihydropyridine and ryanodine receptor binding after eccentric contractions in mouse skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 96 (5), 1619-1625 (2004).
- Dutton, M. . Orthopaedics for the Physical Therapist Assistant. , 238 (2011).
- Begam, M., Abro, V. M., Mueller, A. L., Roche, J. A. Sodium 4-phenylbutyrate reduces myofiber damage in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Applied Physiology, Nutrition, and Metabolism. Physiologie Appliquée, Nutrition et Métabolisme. 41 (10), 1108-1111 (2016).
- Tully, J. J., Meloni, G. N. A scientist’s guide to buying a 3D printer: How to choose the right printer for your laboratory. Analytical Chemistry. 92 (22), 14853-14860 (2020).
- Schwiening, C. 3D printing primer for physiologists. Physiology News. (101), (2015).
- Begam, M., Roche, J. A. Damaged muscle fibers might masquerade as hybrid fibers – A cautionary note on immunophenotyping mouse muscle with mouse monoclonal antibodies. European Journal of Histochemistry. 62 (3), 2896 (2018).
- Lott, D. J., et al. Safety, feasibility, and efficacy of strengthening exercise in Duchenne muscular dystrophy. Muscle & Nerve. 63 (3), 320-326 (2021).
- Lindsay, A., Larson, A. A., Verma, M., Ervasti, J. M., Lowe, D. A. Isometric resistance training increases strength and alters histopathology of dystrophin-deficient mouse skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 126 (2), 363-375 (2019).
- Dalkin, W., Taetzsch, T., Valdez, G. The fibular nerve Injury method: A reliable assay to identify and test factors that repair neuromuscular junctions. Journal of Visualized Experiments. (114), e54186 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
- Brightwell, C. R., et al. In vivo measurement of knee extensor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (169), e62211 (2021).
- Pratt, S. J. P., Lawlor, M. W., Shah, S. B., Lovering, R. M. An in vivo rodent model of contraction-induced injury in the quadriceps muscle. Injury. 43 (6), 788-793 (2012).
- Shields, R. K. Precision rehabilitation: How lifelong healthy behaviors modulate biology, determine health, and affect populations. Physical Therapy. 102 (1), 248 (2022).
- . Medical Rehabilitation Research Resource Network (MR3N). Precision Rehabilitation – Inaugural Scientific Retreat Available from: https://ncmrr.org/education-training/archived-presentations/precision-rehab-archive (2021)
- Roche, J. A., et al. Minimally invasive muscle embedding generates donor-cell-derived muscle fibers that express desmin and dystrophin. Military Medicine. 185, 423-429 (2020).
- Roche, J. A., et al. Minimally invasive muscle embedding (MIME), facilitates the development of functional muscle fibers of human cadaveric origin, in host mice. The FASEB Journal. 33, 602 (2019).
