Summary
본 프로토콜은 마우스와 같은 작은 동물에서 수행되는 정밀 재활 연구에 통합될 수 있는 투여량 조정 저항 훈련(DART)이라는 독특한 기술을 설명합니다.
Abstract
점진적으로 더 큰 외부 부하에 대해 근육 수축을 수행하는 것을 포함하는 점진적 저항 훈련(PRT)은 건강한 개인과 환자 집단에서 근육량과 근력을 증가시킬 수 있습니다. 소형 및 대형 동물 모델에 대한 전임상 연구에서 근육량과 근력을 유지 및/또는 회복하기 위해 PRT의 안전성과 효과를 테스트하기 위한 정밀 재활 도구가 필요합니다. 이 기사에 설명 된 PRT 방법론 및 장치를 사용하여 용량 조정 저항 훈련 (DART)을 수행 할 수 있습니다. DART 장치는 독립형 동력계로 사용하여 마우스의 발목 배굴근에서 생성된 동심 수축 토크를 객관적으로 평가하거나 기존 등속성 역동계 시스템에 추가할 수 있습니다. DART 장치는이 작업에 제공된 지침 및 오픈 소스 3D 인쇄 파일을 기반으로 표준 3D 프린터로 제작할 수 있습니다. 이 기사는 또한 사지 거들 근이영양증 유형 2B/R2(BLAJ 마우스)의 마우스 모델에서 DART의 단일 발작으로 인한 수축 유발 근육 손상과 유사한 등척성 수축(ISOM)으로 인한 근육 손상을 비교하는 연구의 워크플로에 대해 설명합니다. 8 마리의 BLAJ 마우스 (각 조건에 대해 4 마리의 동물)의 데이터에 따르면 경골 전방 (TA) 근육의 10 % 미만이 DART 또는 ISOM의 단일 발작으로 손상되었으며 DART는 ISOM보다 덜 손상되었습니다.
Introduction
운동은 골격근에 수많은 건강상의 이점을 부여합니다 (Vina et al.1에서 검토 됨). 특히, 점진적으로 더 큰 외부 하중(예: 바벨, 덤벨, 케이블 풀리 웨이트 회로)에 대해 근육 수축을 수행하는 것을 포함하는 점진적 저항 훈련(PRT)은 건강한 개인과 환자 집단 모두에서 근육량과 근력을 증가시키는 데 도움이 되는 것으로 알려져 있습니다(이전 간행물 2,3 ). PRT는 근육이 점진적으로 더 큰 외부 하중에 대해 수축할 때 생리적 단면적과 힘생성 능력을 증가시켜 적응한다는 과부하 원리를 기반으로 합니다4. 설치류의 기존 PRT 모델에는 꼬리에 저항이 가해진 사다리 등반, 길항제의 저항에 대한 작용제 근육의 공동 수축, 가중 하네스로 달리기, 전기 충격에 의해 유발되는 쪼그리고 앉는 운동, 바퀴 달리기저항 5,6,7,8,9,10(이전 간 행 물 11,12에서 검토됨) ). 그러나, 현재 인간 임상 연구 및 실습12,13에 사용되는 PRT 방법 및 장치와 매우 유사한 마우스에서 정확하게 근육 표적화, 용량 조정 PRT를 수행하는 연구 도구는 없다. 이것은 연구자가 마우스의 기초 및 전임상 연구에서 정확하게 투여 된 PRT의 안전성과 효과를 연구하는 능력을 제한합니다.
이러한 장벽을 극복하기 위해, 현대 체육관14,15,16의 저항 훈련 장비에 사용되는 케이블 풀리 웨이트 회로 설계를 기반으로 PRT 방법론 및 장치가 본 연구에서 개발된다. 이 PRT 방법을 용량 조정 저항 훈련 (DART)이라고하며이 장치를 DART 장치라고합니다. 정밀 재활 훈련 도구로서의 기능 외에도 DART 장치는 마우스의 경골 전방 (TA) 근육에 의해 생성 될 수있는 최대 동심 수축 토크를 객관적으로 평가하기위한 독립형 기기로도 사용될 수 있으며, 이는 1 회 반복 최대 (1RM, 좋은 형태를 유지하면서 한 번만 성공적으로 들어 올릴 수있는 최대 하중)가 인간에서 평가되는 방식과 유사합니다17, 18. DART 장치는 또한 맞춤형 또는 상용 등척성 동력계와 결합하여 마우스의 TA 근육에 의해 생성된 피크 등척성 파상풍력(인간의 최대 자발적 수축[MVC]에 필적함)을 측정한 다음 피크 파상풍력(예: 피크 힘의 50%)을 기반으로 하는 저항으로 용량 조정 PRT를 수행할 수 있습니다.
이 기사에서는 DART 장치의 구성에 대해 설명하고 수축 토크를 평가하고 DART를 수행하기 위해 이전 간행물 19,20,21,22에서 설명한 맞춤형 동력계와 결합하는 방법을 설명합니다. 이 연구는 또한 DART 장치를 사용하여 사지 거들 근이영양증 유형 2B(LGMD2B, 또는 LGMDR2)23,24. 연구된 마우스 모델에는 유해한 편심 수축 후 지연 발병 근육 손상으로부터 골격근을 보호하는 데 중요한 역할을 하는 디스페린이라는 단백질이 부족합니다. 22,25,26,27,28,29,30 . 또한 dysferlin 결핍 수컷 마우스에서 동심원으로 편향된 강제 운동은 편심적으로 편향된 강제 운동만큼 해롭지 않으며 동심원으로 편향된 훈련에 대한 사전 노출은 편심적으로 편향된 수축의 후속 발작으로 인한 부상으로부터 보호된다는 것이 입증되었습니다22. 현재 연구는 투여량 조정, 동심원 편향 저항 훈련을 수행함에있어 현재 DART 방법론 및 장치의 타당성을 테스트하기 위해 수행 되었기 때문에 수컷 디스 페린 결핍 마우스를 조사를 위해 DART 장치의 새로운 데이터를 이전 데이터와 비교하기 위해 선택되었습니다. 향후 연구에서는 DART에 대한 반응과 관련하여 생물학적 변수로서의 성의 효과를 연구하기 위해 암컷 BLAJ 마우스가 포함될 것입니다. ~ 1.5 세의 마우스는 이미 많은 근육 그룹에서 영양 장애 변화가 있기 때문에 연구되었으며, 따라서 이미 근육 약화와 소모가 있고 근육량과 힘을 유지하기 위해 재활 치료를 찾고있는 환자의 근육이있을 수있는 병태 생리 학적 상태를 모델링합니다26.
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Protocol
이 기사에 설명 된 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드 (1996, National Academy Press, 2101 Constitution Ave. NW, Washington, DC 20055, USA)에 따라 미국 미시간 주 디트로이트에있는 웨인 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 나6. A-Dysfprmd/GeneJ 마우스(일명 BLAJ 마우스, 수컷, ~1.5세)를 LGMD2B/R2 모델로 하여 본 연구에 사용하였다. 마우스는 상업적 공급원으로부터 수득하였다( 재료 표 참조).
1. 연구 설계
- 연구 질문과 관련된 마우스 균주를 선택하십시오 (예 : 연구 B6). A-Dysfprmd / GeneJ 마우스 (BLAJ 마우스)는 동심원 편향 DART가 LGMD2B / R2를 모델링하는 마우스에서 광범위한 근육 손상을 유발하는지 여부에 대한 질문에 답하려고합니다.
- 마우스를 연구 설계에 기초하여 연구 그룹에 할당하고(예: 투여량 조절 저항 훈련(DART) 그룹 또는 등척성 훈련 그룹(ISOM)에 마우스를 무작위로 할당하고, 깔짚 및/또는 연령에 의한 매칭에 기초하여 가능한 한 최상의 그룹 균형을 시도한다(예를 들어, 표 1).
2. DART 장치의 제작
- 아래 단계에 따라 적절한 CAD(컴퓨터 지원) 소프트웨어(그림 1)를 사용하여 DART 장치 구성 요소를 설계합니다.
- 각도기가 내장된 저마찰 휠 베어링용 하우징(필로우 블록 베어링 설계를 기반으로 한 재료 표 참조)(발목 관절 각도를 측정하기 위한 각도계로 사용)을 설계합니다.
- 휠 베어링 하우징과 각도기를 위한 타워를 설계합니다.
- 마우스 발의 위치를 지정하기 위한 발판을 디자인합니다. 발판을 휠 베어링에 연결하는 차축을 설계하십시오.
- 적합한 3D 프린터로 DART 장치 구성 요소를 제조합니다(그림 1).
- CAD 소프트웨어로 만든 설계를 광조형(. STL 확장자) 파일을 참조하십시오.
참고: . STL 파일(보충 코딩 파일 1-4)은 이 기사의 교신저자에게 크레딧을 부여하고 이 기사를 인용하여 사용 및 수정할 수 있습니다. - 를 엽니다. STL 파일을 적절한 슬라이싱 소프트웨어와 함께 사용할 수 있습니다( 재료 표 참조).
참고: 슬라이싱 소프트웨어는 가상 3D 모델을 슬라이스 스택으로 변환하여 3D 프린터로 순차적으로 인쇄하여 3D 개체를 생성할 수 있습니다. - 슬라이싱 소프트웨어를 사용하여 G-CODE 컴퓨터 지원 제조(CAM, . GCODE 확장자) 파일을 사용할 3D 프린터 및 필라멘트에만 해당됩니다.
- 3D 프린터 설명서( 재료 표 참조)에 따라 DART 장치 구성 요소를 . GCODE 파일에 저장됩니다.
- 폴리락트산(PLA) 1.75mm 1kg/스풀, 회색과 같은 적절한 3D 프린터 필라멘트를 선택합니다( 재료 표 참조).
- CAD 소프트웨어로 만든 설계를 광조형(. STL 확장자) 파일을 참조하십시오.
- 아래 단계에 따라 DART 장치를 조립하십시오.
- 608 저마찰 휠 베어링(8mm 보어 직경, 22mm 외경, 420 스테인리스강에 질화규소 세라믹 볼이 있는 휠 베어링, 재료 표 참조)을 휠 베어링 하우징에 삽입합니다(그림 1).
- 차축을 휠 베어링의 보어에 삽입합니다(그림 1).
- PLA를 접착하는 데 적합한 접착제( 재료 표 참조)를 사용하여 발판을 차축에 붙입니다(그림 1).
- 휠 베어링 하우징을 휠 베어링 하우징 타워 위에 놓고 나사 패스너를 사용하여 전체 어셈블리를 아크릴 베이스에 부착합니다(그림 1).
알림: 아크릴 베이스에 대한 특정 크기 요구 사항은 없습니다 — 동물 및 DART 장치를 수용할 수 있을 만큼 충분히 크고 작업 표면에 맞을 만큼 작아야 합니다. 본 연구에 사용된 아크릴 베이스는 폭 약 30cm, 길이 45cm, 두께 0.5cm이다.
3. DART 또는 ISOM용 마우스의 제조
- 스트레스와 통증을 줄이기 위해 적절한 마취 시스템을 통해 흡입된 이소플루란을 전달하여 각 마우스를 전신 마취 하에 두십시오( 재료 표 참조, 유도의 경우 2%-5%, 유지 관리의 경우 1%-4%, 효과).
- 마취 시스템의 유도 챔버에서 마취를 유도합니다 (2 % -5 % 이소 플루 란).
- 동물에 대한 절차를 수행하는 동안 마취를 유지하기 위해 마우스를 코 콘으로 옮깁니다 (1 % -4 % 이소 플루 란). 한 쌍의 핀셋에서 발가락 꼬집음에 뒷다리 철수가 없다는 것을 기반으로 마취 효과를 확인하십시오.
- 열 지원을 제공합니다 — 예를 들어, 등온 젤 가열 패드와 열 램프를 마우스 위 ~1m 위에 배치합니다. 온도계로 확인하여 아크릴 베이스 위와 주변의 온도가 ~38°C로 유지되어 마우스가 과열되지 않도록 합니다.
- DART 또는 ISOM을 위해 마우스의 왼쪽 경골 전방 (TA) 근육과 왼쪽 뒷다리의 전체 전방 및 측면 측면에 피부를 준비하십시오.
- 제모 크림 (탈모 크림, 재료 표 참조)으로 마우스의 모피를 제거하십시오. 탈모 크림을 바르고 ~ 2 분 동안 작동시킵니다.
- 증류수에 적신 물티슈로 다리를 청소하여 피부에서 모피와 모든 잔류 크림을 제거하십시오. 탈모 크림은 쥐의 피부에 장기간 방치하면 피부를 자극 및/또는 손상시킬 수 있으므로 완전히 제거됩니다.
- 모피 제거 후 포비돈-요오드 스크러빙 용액과 70 % 에탄올과 같은 승인 된 스크러빙 방법으로 피부를 소독하십시오.
- 눈과 제모된 피부를 건조로부터 보호하기 위해 깨끗한 면봉으로 눈과 제모된 피부에 보호제(예: 바셀린)를 바르십시오.
- 경골 골단을 통해 안정화 핀을 놓습니다.
- 경골 위에 5 % 리도카인 크림을 바르면 마비됩니다.
- 26G, 반 인치, 멸균 된 피하 주사 바늘을 경골 뼈의 근위 부분의 가장 넓은 부분 (즉, 경골 머리라고도 함)의 가장 넓은 부분을 통과시킵니다. 안정화 핀이 고정되면 멸균 지혈제로 바늘을 잡고 플라스틱 부분이 부러질 때까지 구부려 피하 주사 바늘의 플라스틱 부분을 제거합니다.
- DART 또는 ISOM 훈련을 위해 마우스를 배치합니다.
- 마우스를 앙와위 자세로 놓습니다. 마취를 유지하기 위해 마우스가 여전히 코뿔에 단단히 연결되어 있는지 확인하십시오.
- 한 쌍의 멸균 팁 핀셋을 사용하여 경골 핀의 끝이 악어 클램프로 고정되도록 경골 핀을 금속 악어 클립 ( 재료 표 참조)에 공급합니다. 앨리게이터 클램프의 조정 가능한 암을 움직여 마우스의 발이 DART 장치의 발판에 놓이도록 합니다.
- 접착식 실험실 테이프로 DART 장치 발판에 마우스 발을 묶습니다.
- 마우스 발을 마우스 경골 뼈의 장축에 대해 90° 각도로 놓습니다. 올바르게 배치되면 발판은 아크릴베이스에 수직이됩니다 (즉, 바닥 또는 수평면으로 간주되는 것).
- DART 장치의 각도기에 미리 뚫린 구멍을 통해 18G, 1.5인치 길이의 피하 주사 바늘을 놓아 만든 발판 굴곡 정지 위에 발판을 놓습니다(그림 1).
4. 다트 또는 ISOM 교육
- 양극성, 경피, 신경근 전기 자극(NMES, 재료 표 참조) 전극을 마우스 무릎 관절의 외측 측면에 배치하여 전극 배치를 최적화합니다(그림 1B).
- 실험실 전기 자극기 ( 재료 표 참조)의 단일 펄스 (1Hz)를 사용하여 좌골 신경의 비골 가지를 자극하여 발목 배측 근육에 운동 신경 분포를 제공합니다 (그림 1B).
- 경골 전방 (TA) 근육은 발목 배굴근(31)에 의해 생성 된 총 수축력의 90 % 이상을 차지하기 때문에, 전기적으로 유도 된 경련 수축의 증거에 대해 TA 근육 배 및 힘줄을 관찰한다.
알림: 비골에 해당하는 약간의 뼈 돌출부는 테스터가 전극을 통해 느낄 수 있는 경우 전극 배치에 도움이 될 수 있습니다. 이를 위해서는 최적의 전극 배치에 대한 느낌을 얻기 위해 테스터 측에서 약간의 연습과 학습이 필요합니다. - 발바닥 굴곡 정지를 발이 직교하는 위치(90°)에서 경골까지 족저굴곡의 20°에 해당하는 각도기의 구멍으로 이동합니다 — 이것은 이전 보고서21을 기반으로 TA 근육의 최대 수축 토크가 일반적으로 관찰되는 위치입니다. 이것은 연구되는 마우스에 특정한 요인에 기초하여 사용자에 의해 커스터마이징되어야 할 수도 있다.
- DART 장치 발판을 동력계 발판에 연결하여 마우스 동력계로 트위치 토크를 시각화합니다(예: DART 장치 발판을 비탄성 실크 봉합사가 있는 맞춤형 로봇 발목 동력계 발판에 연결( 그림 1A와 유사) 봉합사를 동력계 발판에 묶습니다( 재료 표 참조).
참고: 발판에는 3D 프린트 디자인에 구멍이 내장되어 있습니다. 발판의 발가락 끝에서 두 번째 줄에있는 한 쌍의 구멍을 통해 봉합사를 배치하면 봉합사가 배측 굴곡 / 족저 굴곡 축에서 ~ 20mm가됩니다 (그림 1A, B). 동력계는 이전 보고서 19,20,21,22에서 설명되었습니다.
- NMES 자극기의 전압 출력을 최적화합니다.
- 전극 배치를 최적화 한 후 전기 자극기에서 출력되는 전압의 진폭을 최적화하십시오 - 이는 NMES를 일반적인 비골 신경 및 TA 근육에 국한시키고 족저 굴곡근의 공동 수축을 유도 할 위험을 줄이는 데 필요합니다.
알림: 공동 수축이 유도되면 동력계의 토크 출력을 통해 시각화 할 수 있으며 발가락의 족저 굴곡에서도 볼 수 있습니다.
- 전극 배치를 최적화 한 후 전기 자극기에서 출력되는 전압의 진폭을 최적화하십시오 - 이는 NMES를 일반적인 비골 신경 및 TA 근육에 국한시키고 족저 굴곡근의 공동 수축을 유도 할 위험을 줄이는 데 필요합니다.
- DART 또는 ISOM 훈련을 위해 NMES 자극기를 설정합니다.
참고: 다음 설정은 연구 중인 마우스와 연구 목적에 특정한 요인에 따라 사용자가 사용자 지정해야 할 수 있습니다.- 주파수가 125 Hz인 반복적인 펄스 트레인을 생성하도록 자극기를 설정하십시오 — 이 주파수는 BLAJ 마우스21에서 다른 근육 그룹으로 NMES가 넘치지 않고 최대 융합 파상풍 수축을 생성합니다. 펄스 주파수(125Hz), 열차 지속 시간(500ms) 및 초당 열차(1열차/초)에 대한 다이얼을 조정하고 반복되는 펄스 열의 토글 스위치를 켜서 이를 수행합니다.
- 펄스 트레인 사이에 500ms 휴식이 산재된 지속 시간이 500ms인 펄스 트레인을 생성하도록 자극기를 설정합니다.
- 족저 굴곡 정지를 경골의 장축에 대해 160°에 해당하는 각도기의 구멍으로 이동합니다(발에서 직교하여 경골까지 70° 족저 굴곡). 이것은 BLAJ 마우스의 발이 연조직 저항없이 수동적으로 움직일 수있는 위치입니다21.
- DART의 경우 TA 근육이 동심원으로 작동해야하는 적절한 저항을 적용하십시오 (예 : 그림 1A, B와 같이 5g). 보충 파일 1의 질량 대 토크 교정 곡선을 참조하십시오.
- DART 장치 발판에 묶인 비탄성 실크 봉합사로 추를 걸어 저항을 가합니다(그림 1A, B).
- 저항 조정 - 즉, 1회 반복 최대값(1RM)의 ~50%(예: 마우스가 단일 수축으로 최대 무게 10g을 들어 올릴 수 있는 경우 5g)를 적용하여 사용 가능한 활성 배측 굴곡 범위의 절반 이상을 통해 발을 당깁니다.
- DART 그룹에 배정 된 마우스에서 적절한 DART 훈련을 수행하십시오 - 예를 들어, 인간에서 사용되는 점진적 저항 훈련 프로그램과 유사하게 세트 사이에 2 분 휴식과 함께 동심 수축의 10 회 반복의 4 세트를 포함하는 DART 훈련의 단일 시합을 수행하십시오32 ( 보충 비디오 1 참조).
- ISOM 그룹에 배정된 마우스에서 적절한 ISOM 훈련을 수행합니다 — 예를 들어, DART와 유사하게 등척성 수축을 10회 반복하고 세트 사이에 2분 휴식을 취하는 4세트를 포함하는 ISOM 훈련을 한 번 수행합니다( 보충 비디오 2 참조).
- ISOM 훈련의 경우 마우스의 발을 경골의 장축에 160°(발에서 직교에서 경골까지 70° 발바닥 굴곡)에 놓고 실크 봉합사를 로봇 동력계의 발판에 테이프로 붙여서 이 정적 위치를 유지합니다.
알림: 봉합사가 미끄러질 수 없기 때문에 DART 장치 발판이 배측 굴곡으로 이동할 수 없으므로 배측굴곡근이 등척성으로 수축하도록 제한됩니다.
5. 마우스에 대한 시술 후 관리
- 운동 된 뒷다리의 적절한 위생을 유지하고 바늘 부위 통증을 줄이기 위해 예방 조치를 취하십시오.
- DART 또는 ISOM 훈련 후 경골 핀의 보이는 부분을 삼중 항생제 연고(바시트라신 400U/g, 네오마이신 3.5mg/g, 폴리믹신-B 5000U/g, 재료 표 참조)로 코팅한 다음 경골의 내측에서 핀을 조심스럽게 빼냅니다. 측면 허벅지와 다리 위쪽의 피부를 포비돈 요오드와 멸균 수로 헹굽니다. 경골에 5% 리도카인 크림을 바르면 바늘 부위 통증을 조절할 수 있습니다.
- 마우스가 마취에서 회복되도록하십시오.
- 코 콘에서 마우스를 제거하고 침구가없는 회복 케이지에서 마취에서 회복되도록하십시오. 마우스가 마취에서 회복되는 동안 열을 지원합니다(예: 등온 젤 가열 패드).
- 마우스가 마취에서 완전히 회복 된 후 마우스를 원래 케이지로 되돌립니다. 그런 다음 후속 실험이 수행 될 때까지 연구 마우스가 수용되는 동물 시설로 케이지를 되돌립니다. 마우스를 매일 모니터링하십시오.
6. 조직 수집
- 마우스 TA 근육을 완전히 수확하고 아래 단계에 따라 냉동 보존을 위해 스냅 동결합니다.
- 연구 질문에 기초하여, 훈련 후 적절한 시간(예를 들어, DART 또는 ISOM 후 3일)에, 승인된 프로토콜에 따라 마우스를 안락사시킨다.
참고: 본 연구를 위해, 마우스는 전신 마취 하에 자궁경부 탈구에 의해 안락사되었습니다(흡입된 이소플루란, 효과에 대한 2%-5%). 양측 개흉술은 사망을 보장했습니다. - 마우스 뒷다리를 해부하여 운동한 TA 근육(왼쪽)과 운동하지 않은 TA 근육(오른쪽)을 제거합니다. 수확 된 근육의 무게를 측정하십시오. 그런 다음 냉동 보호를 위해 각 근육을 미네랄 오일에 담그고 근육을 깨끗한 실험실 물티슈에 올려 여분의 오일21을 닦아냅니다.
- 연구 질문에 기초하여, 훈련 후 적절한 시간(예를 들어, DART 또는 ISOM 후 3일)에, 승인된 프로토콜에 따라 마우스를 안락사시킨다.
- 알루미늄 호일 위에 근육을 놓습니다. 긴 지혈제로 호일의 가장자리를 잡고 호일과 근육을 적절한 플라스틱 용기에 담긴 액체 질소에 빠르게 담그면 근육이 얼어붙습니다.
- 액체 질소에 약 2 분 동안 담근 후 냉동 근육을 라벨이 붙은 극저온 바이알로 옮깁니다. 추가 연구에 필요할 때까지 바이알을 -80 ° C 냉동고에 보관하십시오.
7. 근육 조직에 대한 조직학적 연구
- 두께가 5μm 인 TA 근육의 저온 유지 장치 섹션을 준비하십시오. 저온 유지 장치 섹션을 충전된 현미경 슬라이드에 수집합니다. -30 ° C에서 차갑게 유지 된 아세톤으로 섹션을 고정하고 섹션을 자연 건조시킵니다.
- 근육 조직 절편을 헤마톡실린으로 염색한 후 eosin을 염색한다(H&E 염색, 재료 표 참조).
- 유리 얼룩 병에 헤 마톡 실린 (진한 파란색 핵 얼룩)에 5 분 동안 섹션을 담그십시오. 물이 더 이상 파랗지 않을 때까지 수돗물로 섹션을 헹구어 과도한 헤마톡실린을 제거합니다.
- 유리 병에 블루 링 시약에 5 분 동안 섹션을 담그십시오. 유리 흡입 피펫으로 섹션에서 과도한 블루잉 시약을 흡입합니다.
- 유리 염색 병에 에오신 (분홍색 세포질 얼룩)에 5 분 동안 섹션을 담그십시오. 유리 염색 용기의 95 % 에탄올에 섹션을 빠르고 반복적으로 (~ 10 회) 담가 과도한 에오신을 제거합니다.
- 섹션을 자연 건조시키고 광학 현미경으로 시각화를 진행합니다.
- 현미경 이미징을 통해 전체 TA 근육 단면의 고해상도 타일 이미지를 준비합니다.
참고: 사용자는 현미경과 이미지 획득 및 분석 소프트웨어를 기반으로 다음 이미징 및 이미지 분석 단계를 사용자 정의해야 할 수 있습니다.- 광학 현미경의 10x 대물 렌즈와 현미경에 장착된 디지털 카메라로 디지털 이미지를 캡처합니다.
- 그리드와 같은 방식으로 각 근육의 단면을 따라 이동하는 약 15-20 개의 이미지를 캡처하여 각각의 새 이미지가 이전 이미지와 ~ 25 % 겹치도록합니다.
참고: 이 프로세스는 디지털 타일링(이미지 스티칭이라고도 함)할 수 있는 이미지 세트를 캡처하여 전체 TA 근육 단면의 고해상도 합성 이미지를 생성하는 데 도움이 됩니다(그림 2). - 에 디지털 이미지를 저장합니다. TIFF 형식으로 저장할 수 있습니다.
- 적절한 이미지 처리 및 분석 소프트웨어로 디지털 이미지를 엽니다( 재료 표 참조).
- 다음 단계를 통해 개별 이미지를 전체 TA 근육의 합성 이미지로 타일링하거나 스티칭합니다. 소프트웨어에서 각 TA 근육의 모든 개별 겹치는 이미지가 열린 상태에서 파일을 클릭하고 자동화>> 선택한 > 콜라>주를 선택하고 열린 파일 추가를 선택한 > 확인을 클릭합니다.
- TA 근육의 새 타일/스티칭 이미지가 준비되고 표시되면 이미지를 에 저장합니다. 추가 분석을 위한 TIFF 형식입니다.
- 적절한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 전체 TA 근육의 타일 이미지에서 시각적 분석을 통해 근육 손상을 정량화합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어에서 분석 메뉴의 측정 기능을 선택하여 전체 TA 근육 단면의 윤곽을 잡고 측정합니다(그림 2).
- 이미지 분석 소프트웨어에서 분석 메뉴의 측정 기능을 선택하여 손상된 각 TA 근육의 영역, 즉 근육 섬유의 세포질 파괴, 근육 섬유 부재 및 염증 세포 침윤을 나타내는 영역(그림 2)의 윤곽을 잡고 측정합니다(그림 2).
- 전체 TA 근육 단면적에 대한 전체 손상 면적의 합을 백분율로 표현합니다(그림 2, 표 2).
8. 통계 분석
- 표 1-3과 같이 데이터를 구성하고 적절한 소프트웨어를 사용하여 비쌍체 T-검정(정규성 및 균질 분산 검정을 통과한 경우)33 또는 Mann-Whitney 순위 합 검정(정규성 및 동종 분산 검정을 통과하지 못한 경우)21을 수행합니다.
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Representative Results
~1.5세 나이의 BLAJ 수컷 마우스를 연구했습니다. BLAJ 마우스는 인간 근육 질환인 LGMD2B/R2를 모델링합니다. 이들 마우스는 편심 근육 수축의 단일 시합으로부터 지연된 발병 근육 손상에 특히 취약하다(22,29). 따라서 BLAJ 마우스는 TA 근육이 동심원으로 편향된 방식으로 작동해야하는 저항을 정확하게 조정하여 DART를 비 해롭지 않은 방식으로 수행 할 수 있는지 알아보기 위해 이러한 연구를 위해 선택되었습니다. DART가 BLAJ 마우스에 해롭지 않은 것으로 밝혀지면 단독으로 또는 재생 의학, 유전, 약리학 및 기타 중재의 보조제로 적용될 수있는 비 해롭지 않은 저항 훈련의 한 형태로 유용 할 것입니다.
BLAJ 마우스의 연령 및 체중은 DART 및 ISOM 그룹 간에 밀접하게 일치하였다(표 1). 3일차(~72시간)에 한 번의 훈련 후 운동한 TA 근육은 DART 및 ISOM 그룹 모두에서 낮은 수준의 손상을 보였습니다(<10% 손상 영역) — 이는 편심 근육 수축에 대한 BLAJ 마우스의 반응에 대한 과거 연구21,22와 대조되며, 3일째에 ~40%의 손상된 섬유가 보고되었습니다(그림 2, 표 2). 근육 손상 영역을 DART 그룹과 ISOM 그룹의 운동 된 TA 근육간에 비교했을 때, DART 그룹은 ISOM 그룹보다 근육 손상 수준이 낮다는 것을 알 수있었습니다 (그림 2, 표 2). 0일차(기준선)와 3일차에 기록된 최대 파상풍 토크는 DART 그룹과 ISOM 그룹 간에 통계적으로 차이가 없었습니다(표 3).
그림 1: DART 장치를 제작하여 훈련 연구에 적용. (A,B) DART 장치는 인간을 위해 설계된 저항 훈련 장비에 공통적 인 케이블 풀리 웨이트 회로 설계를 기반으로합니다. (A) DART 훈련 세션 동안 동물과 함께 DART 장치. (B) TA 근육의 동심원 수축 동안 배측 굴곡으로 이동하는 발판 (곡선 녹색 화살표, 오른쪽). 동심원 수축으로 인해 5g 저항이 중력에 대해 수직으로 움직입니다(수직 녹색 화살표, 왼쪽). 근육 수축은 경피 양극성 전극을 통해 적용된 전기 자극으로 유도되었습니다. (C) DART 장치의 다양한 구성 요소는 광 조형 소프트웨어를 사용하여 설계되었습니다. STL 파일을 열고 슬라이싱 소프트웨어로 열 수 있습니다. 슬라이싱 소프트웨어를 사용하면 G-CODE 파일이 사용 된 3D 프린터 및 필라멘트에 따라 생성되었습니다. DART 장치의 3D 인쇄 구성 요소에는 (C) 608 저 마찰 휠 베어링 용 하우징, (D) 휠 베어링 하우징 용 타워, (E) 발판 및 (F) 발판을 휠 베어링에 연결하기위한 차축이 포함됩니다. 3D 인쇄 된 구성 요소는 텍스트에 설명되어 있고 (A)에 표시된대로 접착제와 나사 패스너로 아크릴베이스에 결합되고 장착되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 조직 학적 연구. 3일차에 TA 근육의 조직학적 변화 (A) DART 후 또는 (B) 이소m 후. 두께가 5μm인 냉동 절편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 여러 개의 겹치는 디지털 이미지를 캡처하고 이미징 소프트웨어와 병합하여 전체 TA 근육 단면의 고해상도 타일 이미지를 생성했습니다. 질적 조직학적 데이터는 DART 및 ISOM 그룹 모두에서 근육 손상의 정도가 낮았지만 근육 손상은 ISOM 그룹 모두에서 약간 더 분명하다는 것을 나타냈습니다. 노란색 화살표는 TA 근육 단면의 손상된 부위 중 일부를 가리킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 마우스의 연령 및 체중. 연구 된 BLAJ 마우스는 DART와 ISOM 그룹간에 유의 한 차이없이 연령과 체중이 밀접하게 일치했습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: TA 근육 손상의 정량 분석. 근육 손상 정도는 TA 근육 단면의 전체 면적에 대한 백분율로 나타내고 T-test로 분석했습니다. DART와 ISOM 훈련 모두 BLAJ 마우스에서 유사한 편심 수축을 포함하는 과거 연구와 비교할 때 3일차에 낮은 수준의 근육 손상을 초래했습니다. 근육 손상의 크기는 DART 및 ISOM 그룹 모두에서 작았지만 DART 그룹에서는 손상 정도가 통계적으로 낮았습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 수축 토크 데이터. 배측 굴곡근에 의해 생성된 수축 토크는 DART 장치에 연결된 로봇 동력계로 연구되었습니다. 운동 당일(A, 0일차) 또는 운동 후 3일(B, 3일차)에 측정된 최대 기준선 파상풍 토크에서 DART 그룹과 ISOM 그룹 간에 유의미한 차이는 없었습니다. 광범위한 근육 손상에 대한 조직학적 증거가 없음에도 불구하고 DART와 ISOM의 단일 시합은 3일차에 수축 토크 적자(~40%)와 관련이 있었습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 1 : 마우스에서의 DART 훈련. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 2: 마우스에서의 ISOM 훈련. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 중량 대 토크 교정 데이터, 곡선 및 설정. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 1-4: DART 장치 구성 요소에 대한 설계. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 기사에서는 용량 조정 저항 훈련(DART)이라고 하는 일종의 정밀 재활 훈련을 수행하기 위해 장치를 구성하는 방법에 대한 단계별 지침을 제공합니다. 이 연구는 또한 DART (DART 그룹)의 단일 시합 후 3 일 후 근육 손상과 유사한 등척성 훈련 (ISOM 그룹) 후 3 일 손상을 비교하는 훈련 연구에서 DART 장치 및 방법론의 적용을 설명합니다.
프로토콜의 중요한 단계는 DART 장치 34,35의 적절한 구성, DART 또는 ISOM 훈련 수행과 관련된 정확한 단계, 근육 조직의 적절한 수확 및 냉동 보존, 저온 유지 장치를 사용한 근육 조직의 적절한 절편 및 헤마톡실린 및 에오신22,36을 사용한 근육 단면의 적절한 염색입니다. . 특히, DART 장치를 구성하려면 부품을 정확한 치수와 최적의 재료 특성으로 제작해야 합니다. 휠 베어링 하우징의 치수가 정확하지 않으면 608형 휠 베어링이 휠 베어링 하우징에 꼭 맞지 않습니다. 마우스 발판과 차축의 치수가 정확하지 않으면 휠 베어링이 마우스 발과 함께 움직이는 능력에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. DART 장치 부품이 부적합한 재료 및/또는 3D 프린터 설정으로 제조되는 경우, DART 장치 부품은 충분한 기계적 강도가 결여될 수 있고, 이는 다양한 구성요소(34)의 굽힘 및/또는 파손을 초래할 수 있다.
이 프로토콜의 수정은 연구자가 답변하고자하는 특정 연구 질문에 따라 필요할 수 있습니다. 현재의 프로토콜은 우리가 이전에 편심 수축의 유사한 한판 승부로 보고한 바와 같이, DART의 단일 시합이 디스페린 결핍 마우스에서 TA 근육에 광범위한 손상을 유발하는지 여부에 대한 질문에 답하려고 시도한 연구에서 DART 장치를 설계하고 구현하는 데 특화되어 있습니다.22. 다른 사람들은 등척성 수축으로 구성된 운동이 해롭지 않을 수 있으므로 특정 근육 질환이 있는 사람에게 적합할 수 있다고 제안했기 때문에 DART로 인한 근육 손상 정도를 유사한 등척성 수축(ISOM)37,38과 비교했습니다. 이 연구에서 우리는 DART와 ISOM이 모두 최소한의 근육 손상을 유도하고 DART가 ISOM보다 약간 있지만 현저히 낮은 수준의 손상을 보인다는 것을 발견했습니다.
문제 해결과 관련하여 프로토콜의 가장 어려운 측면은 좌골 신경의 비골 가지를 정확하게 자극하여 TA 근육에 운동 신경 분포를 제공하는 것입니다. 이 기술은 테스터가 경피 전극을 보유하고, 마우스의 무릎 관절(20, 39)보다 열등하고 측면인 정확한 지점에 수동으로 배치하기 때문에 특히 도전적이다. 테스터는 마우스의 비골(40)의 머리에 해당하는 약간의 뼈 돌출을 느끼면서 마우스의 뒷다리에서 이 지점을 찾는 방법을 연습하고 배워야 합니다. 좌골 신경의 비골 가지의 최적의 전기 자극이 달성되고 있는지 확인하려면 TA 근육의 최대 수축이 이루어지도록 신뢰할 수있는 동력계 시스템을 사용하는 것이 가장 좋습니다20,21,22,41. 더욱이, 클램프에 의해 안정화된 경피 또는 피하 전극은 또한 사용자-유도된 가변성 및 에러(20,41,42,43)를 최소화하기 위해 전극의 신뢰성 있고 재현가능한 배치를 위해 고려될 수 있다.
프로토콜의 주요 한계는 마우스의 TA 근육에 대한 DART의 효과를 연구하도록 특별히 설계되었다는 것입니다. 설치류의 대퇴사 두근 근육 그룹에 대한 동력 측정 평가 및 강제 운동을 수행하기 위해 개발 된 방법을 사용하면 DART 장치를 대퇴사 두근 대퇴근 근육 그룹42,43에 쉽게 적용 할 수 있습니다. DART 장치를 다른 근육 그룹에 적용하는 것이 더 어려울 수 있습니다. 그러나 DART 장치에 사용 된 케이블 풀리 웨이트 회로 설계는 다른 근육 그룹에 적합한 장치에 통합 될 수 있습니다. 또 다른 한계는 프로토콜이 전신 마취하에 수행되어 운동을 자발적이지 않고 강제적으로 만든다는 것입니다. 이것은 인간을 위해 개발 된 대부분의 저항 훈련 패러다임과 다릅니다12,21.
기존 또는 대안적인 방법과 관련하여 DART 장치 및 방법론의 중요성은 저항 훈련을 위한 투여량이 정밀하게 조정될 수 있고 운동이 특정 근육 그룹(12)에 정확하게 표적화될 수 있다는 것이다. 정밀 재활은 미국 국립 보건원의 새로운 전략적 우선 순위이며, DART를 사용하면 마우스에서 정밀 저항 훈련을 수행 할 수 있기 때문에 DART는 정밀 신체 재활에 대한 기본 및 전임상 연구에 적합합니다44,45.
투여량 조절된 저항 훈련을 수행하는 현재의 방법의 중요성 및 잠재적 적용은 임상 재활 연구 및 실습에 사용되는 인간 테스트 및 훈련 프로토콜에 필적하는 방식으로 마우스에서 저항 훈련 연구를 수행하는 것을 가능하게 한다는 것이다. 예를 들어, 1회 반복 최대값(1RM, 좋은 형태를 유지하면서 한 번만 성공적으로 들어올리고/이동하고/누르고/쪼그리고 앉을 수 있는 최대 하중)을 사용하여 훈련 시합(17,18)에 대한 저항의 크기를 조정하는 것처럼, TA 근육이 성공적으로 들어 올릴 수 있는 최대 하중은 DART 장치를 사용하여 마우스의 훈련을 위한 저항을 설정하는 데 사용할 수 있습니다. 동물의 능력에 기초하여 저항을 조정하는 것 외에도, 추가적인 이점은 수축이 동심원으로 편향되어 수축으로 유도된 근육 손상을 감소시키는 데 도움이 된다는 것이다(22). 대표적인 결과는 DART의 한 번의 시합이 비슷한 등척성 수축 (ISOM 그룹)보다 훨씬 덜 해롭다는 것을 시사합니다. DART의 비 해롭지 않은 특성은 유해한 수축을 피하는 것이 가장 좋은 훈련 연구 (예 : 근이영양증을 모델링하는 마우스의 훈련 연구 및 근육 및 / 또는 힘줄에 대한 실험적 수술 절차 22,46,47)에 따라 점차적으로 근육을 재 장전하도록 설계된 훈련 연구에 적합합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 Jain Foundation Inc.의 보조금, NICHD의 R03HD091648, NIH P2CHD086843에 따른 AR3T의 파일럿 보조금, Wayne State University의 EACPHS의 FRAP Award, Wayne State University의 교수진 스타트 업 패키지 및 1R01AR079884-01 (Peter L. Jones PI)에서 JAR로의 하청 계약으로 자금을 지원했습니다. 이 연구는 또한 JMB, MEP 및 JAR에 대한 미국 물리 치료 협회-미시간 (APTA-MI) 연구 보조금의 지원을 받았습니다. 저자는 원고를 비판적으로 읽고 피드백을 제공한 Renuka Roche 박사(미시건 이스턴 미시간 대학교 부교수)에게 감사를 표합니다. 저자는 3D 프린팅에 대한 조언을 구한 Anselm D. Motha 씨를 인정합니다. 저자는 https://www.jain-foundation.org/patient-physician-resources/patient-stories 의 자이나교 재단 웹 사이트에서 자신의 이야기, 특히 운동 경험을 공유 한 dysferlinopathes 환자에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnMiao Star 608 Ceramic Ball Bearing | Anmiao Star (N/A) | AMS127 | High precision, low friction wheel bearing. If make and model is not commercially available, an alternative version of a 608 low-friction wheel bearing, 8 mm bore diameter, 22 mm outside diameter, with silicon nitride ceramic balls in 420 stainless steel housing should suffice. Excess friction in the wheel bearing will adversely impact performance of the DART device and will increase overall resistance to muscle contractions. |
| Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
| B6.A-Dysfprmd/GeneJ (a.k.a. BLAJ mice) | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Special colony maintained by The Jain Foundation Inc. for collaborators who study dysferlin. | Stock #012767 | Dysferlin deficient mice that model human limb girdle muscular dystrophy type 2B/R2. |
| Bipolar, transcutaneous, neuromuscular electrical stimulation (NMES) electrode | Harvard Apparatus, Holliston, MA | BS4 50–6824 | Electrode for NMES. If this electrode is not commercially available, please contact corresponding author for alternatives. |
| Coplin Staining Dish | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog No. S17495 | Staining dish/jar for hematoxylin and eosin (H&E) staining of sections |
| Cura 4.4.1. Software | Ultimaker, Utrecht, Netherlands | Ultimaker Cura 4.4.1. | Slicing software to convert stereolithography files into G-CODE files |
| Deltaphase isothermal gel heating pad | Braintree Scientific (Braintree, MA) | Item #39DP | Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia |
| Eosin Y | Millipore Sigma (Burlington, MA) | HT110132-1L | Pink cytoplasmic stain |
| Gorilla Super Glue | The Gorilla Glue Company (Cincinnati, OH) | Gorilla Super Glue Micro Precise | Cyanoacrylate adhesive to bond PLA components |
| Hematoxylin solution, Gill No.3 | Millipore Sigma (Burlington, MA) | GHS332-1L | Dark blue stain for nuclei |
| HM525NX cryostat | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog #HM525NX | Cryostat to make frozen sections of muscle |
| Lab Wipes. Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog No. 06-666. Manufacturer #34120 | Laboratory wipes to blot mineral oil from muscle tissue before snap freezing and for other purposes. |
| Labview 2014 | National Instruments, Austin, Texas, USA | Labview 2014 | Software for custom-written programs/routines that operate the dynamometer and trigger the NMES stimulator. |
| Liquid nitrogen HDPE Dewar Flasks | ThermoFisher (Waltham, MA) | S34074B. Thermo Scientific 41502000/EMD | Flask to hold liquid nitrogen for snap freezing muscle or other tissue |
| Magic depilatory cream | Softsheen Carson (New York, NY) | N/A | Razorless hair removal cream |
| Metal alligator clip | JINSHANGTOPK (web-based business) | 24Pcs 51mm Metal Alligator Clip Spring Clamps | Spring clamp to hold tibial pin |
| Micrscope slides | Globe Scientific (Mahwah, NJ) | 1354W. Diamond White Glass Slides | Charged microscope slides |
| Mineral Oil | ThermoFisher (Waltham, MA) | BP26291 | Mineral oil to cryoprotect muscle tissue before snap freezing |
| Monoprice Premium 3D Printer Filament PLA | Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) | #11778 | Premium 3D Printer Filament PLA 1.75mm 1 kg/spool, Gray. This is the material used to 3D print device components. |
| Monoprice Select Mini V2 3D printer | Monoprice (Rancho Cucamonga, CA) | Mini V2 3D | 3D printer for computer-aided fabrication of device components. |
| NIH Image software | National Instritues of Health (NIH, Bethesda, MD) | NIH Image for Windows | Image processing and analysis software used to quantify area of muscle damage. NIH Image is also known as Image J. |
| Photoshop CS4 | Adobe (San Jose, CA) | Creative Suite (CS4). 64 bit version for Windows | Image processing and analysis software used to generate tiled/stiched images of entire muscle cross-section from images of indvidual overlapping fields |
| PSIU6 stimulation isolation unit | Grass Instruments (West Warwick, RI) | PSIU6 isolation unit | Isolation unit for NMES. Stimulators, such as Model 4100 from A-M come with a built in stimulation isoloation unit |
| Roboz 4-0 silk black braided suture material | Roboz Surgical (Gaithersburg, MD) | Roboz Surgical SUT152 | Suture material to connect DART device footplate to dynamometer footplate or resistance for resistance training |
| S48 square pulse stimulator | Grass Instruments (West Warwick, RI) | S48 Stimulator | Laboratory electrical stimulator for NMES . If this stimulator is not commercially available, Model 4100 Isolated High Power Stimulator from A-M systems could be an alternative. Please contact co-author Jones for more information. |
| Scott’s bluing reagent | Ricca Chemical Company (Arlington, TX) | 6697-32 | Bluing solution that intensifies hematoxylin nuclear staining |
| SigmaStat version 3.5 | Systat Software (San Jose, CA) | SigmaStat version 3.5 | Statistical software package for statistical analyses |
| Tabletop isoflurane vaporizer | VetEquip (Livermore, CA) | Item #901801 | Inhaled tabletop anesthesia system |
| Triple antibiotic first aid ointment | Global Health Products (wed-based business) | Globe Triple Antibiotic First Aid Ointment, 1 oz (2-Pack) First Aid Antibiotic Ointment | Antibiotic ointment applied on tibial pin as part of post-procedural care |
References
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