用于心胸外科的青春期前小鼠幼崽的麻醉和插管
Summary
>7 日龄小鼠的心胸外科模型需要插管，但这对青春期前（8-14 天大）小鼠幼崽具有挑战性，并且关于插管麻醉方案的信息很少。在这里，我们提出了氯胺酮/甲苯噻嗪/阿托品在 10 天大的 C57BL/6J 小鼠幼崽中的剂量方案，允许气管插管，同时最大限度地减少动物死亡率。
Abstract
小鼠手术模型在临床前研究中起着重要作用。可以从0-14日龄小鼠的心胸外科模型中获得心脏损伤后心肌再生的机制见解，其心肌细胞与成人不同，保留增殖能力。7天大的小鼠幼崽通过体温过低有效地固定，心胸外科手术不需要插管。然而，青春期前（8-14 天大）小鼠幼崽确实需要插管，但这具有挑战性，并且几乎没有关于麻醉以促进插管的信息。在这里，我们提出了氯胺酮/甲苯噻嗪/阿托品在 10 天大的 C57BL/6J 小鼠幼崽中的剂量方案，允许气管插管，同时最大限度地减少动物死亡率。氯胺酮/甲苯噻嗪/阿托品剂量方案对体重的经验滴定表明，不同体重的小鼠幼崽对麻醉的反应是非线性的，其中20/4/0.12mg/kg、30/4/0.12mg/kg和50/6/0.18mg/kg的剂量促进了体重在3.15-4.49g（n = 22）、4.50-5.49g（n = 20）和5.50-8.10g（n = 20）之间的幼崽插管， 分别。体重较轻的幼崽比较重的幼崽需要更多的插管尝试（p < 0.001）。插管后生存率与体重相关（低体重、中体重和高体重组分别为 59%、70% 和 80%，R2 = 0.995）。对于插管后的心肌梗死手术，用4.5%异氟烷在100%氧气中诱导麻醉手术平面，并在100%氧气中用2%异氟醚维持。三个体重组的术后生存率相似，分别为92%、86%和88%（p=0.91）。再加上插管和手术动物处理实践的改进，以及手术后母亲的自相残杀，整个手术（插管加手术）的总生存期与体重相关（低、中、高体重组分别为 55%、60% 和 70%，R2 = 0.978）。鉴于 10 日龄幼犬插管遇到的困难以及相关的高死亡率，我们建议 10 日龄幼犬的心胸外科手术仅限于体重至少为 5.5 g 的幼犬。
Introduction
小鼠模型是临床前心胸研究中的宝贵工具，特别是因为可以轻松生成基因工程小鼠系，并且易于通过手术操作小鼠以提供病理疾病模型，例如，研究心脏损伤后的心肌再生1.在这方面，有趣的是，与心肌细胞已退出细胞周期的成年小鼠不同，0-2天大的新生小鼠心脏在心尖切除或诱导心肌梗死后以最小的疤痕修复2，3，4。相比之下，7 天大的新生儿心脏再生不完全，瘢痕形成发生率更高2，3。由于左心室顶端的心肌细胞在出生后长达2周内保持增殖能力，因此0-14日龄小鼠心脏损伤后再生的机制研究可能有助于确定受损成人心脏再生的治疗靶点5。
心脏损伤小鼠模型的开发涉及麻醉下的手术操作。这需要打开胸部以进入心脏，这通常需要插管和机械通气。小鼠品系、体重和年龄影响对麻醉剂的敏感性6.成年小鼠可以用多种药物麻醉，一种常见的插管方案是氯胺酮/甲苯噻嗪/阿托品，浓度为100/13/0.5mg/kg6，7。新生小鼠（0-7日龄）缺乏集中性疼痛反射，可以有效地固定在冰上，无需插管即可进行手术6，8，9。青春期前（8-14天大）小鼠幼崽不能用低温麻醉9，10;他们需要插管进行心胸外科手术。以前没有关于14天以下青春期前小鼠心胸外科手术的研究。根据我们的经验，14日龄以下异氟烷麻醉的青春期前小鼠的插管是困难的。为7天以上的小鼠报告的推荐注射麻醉方案为50-150mg / kg氯胺酮和5-10mg / kg甲苯噻嗪10。青春期前的小鼠仍在神经发育，它们对药物和药物代谢的反应与成年动物有很大不同6。这增加了液体、电解质和酸碱失衡的风险，以及低血糖和体温过低的风险，这不仅是因为它们的高代谢率会迅速耗尽它们有限的能量储存，而且还因为它们的体温调节不成熟6，11，12。因此，关于既能促进插管又能最大限度地提高青春期前小鼠存活率的麻醉方案的信息很少。
在这里，我们经验滴定了10天大的C57BL / 6J小鼠幼崽中氯胺酮/甲苯噻嗪/阿托品的剂量方案，重量范围为3-8g，以达到足够的麻醉平面，允许气管插管进行后续心胸手术，同时最大限度地减少动物死亡率。我们还改进了动物处理方法，以降低插管、手术和手术后母体同类相食的死亡率。
Protocol
Representative Results
Discussion
目前，没有充分记录的麻醉和插管10日龄小鼠用于心胸外科手术的方法。为此，我们根据体重滴定氯胺酮/甲苯噻嗪/阿托品剂量方案，其中20/4/0.12mg/kg、30/4/0.12mg/kg和50/6/0.18mg/kg的剂量分别有助于低体重（3.15-4.49g）、中重（4.50-5.49g）和高（5.50-8.10g）的幼崽插管。插管后生存率与体重相关（低、中、高体重组分别为 59%、70% 和 80%）。鉴于 10 日龄幼犬插管遇到的困难以及相关的高死亡率，我们建议 10 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了NHMRC计划资助[ID 1074386]，Leducq跨大西洋心血管研究卓越网络资助[RMG]和RT Hall Trust[RMG和SEI]的资助。
Materials
| Atipamezole (Antisedan) | Provet (NSW) Pty Ltd | ATIP I | |
| Atropine 600 mcg/mL | Clifford Hallam Healthcare Pty Ptd | 1957699 PFIZER-0143386 | |
| Betadine | Livingstone International | BU0520 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Provet (NSW) Pty Ltd | TEMG I | |
| Fiber-optic light | Leica | 3011350 | CLS 150X |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 9.1.2 | |
| Intubation platform | – | – | Any sturdy box (e.g. plastic tip box) with approximate dimensions 12 (L) x 8.5 x (W) x 7.5 cm (H) |
| Isoflurane | Provet (NSW) Pty Ltd | ISOF 07 | |
| Ketamine 100 mg/mL | Provet (NSW) Pty Ltd | KETAI1 | |
| Plastic intravenous cannula 24-gauge Polywin Safety | BD Insyte | CE0086 | 19 mm length of plastic tubing (0.7 mm outer diameter) attached to a 21mm plastic female luer lock adaptor; total volume of annula 130 μL |
| Single lumen polyethylene tube | Critchley Electrical Products Pty Ltd Auburn NSW | Outer diameter 0.61 mm, inner diameter 0.28 mm | |
| Small forceps | F.S.T. | NO 11051-10 | |
| Surgical microscope (camera optional) | Leica | M651 (Leica IC80 HD camera) | 10x and 16x objective |
| Suture 7-0 prolene | Ethicon | 8708H | |
| Suture 9-0 polypropylene monofilament | Ethicon | 2813 | |
| V-1 Tabletop with Active Scavenging isoflurane anesthesia systm | VetEquip | 901820 | |
| Vented 2-Liter plexiglass induction chamber | VetQuip Pty Ltd | 942102 | 25 cm (L) x 13 cm (W) x 11 cm (H) |
| Warming lamp | Brilant Lighting | 99223 | |
| Xylazine | Provet (NSW) Pty Ltd | XYLA Z 2 |
References
- Klocke, R., Tian, W., Kuhlmann, M. T., Nikol, S. Surgical animal models of heart failure related to coronary heart disease. Cardiovascular Research. 74 (1), 29-38 (2007).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157 (4), 795-807 (2014).
- Bogush, N., et al. DUSP5 expression in left ventricular cardiomyocytes of young hearts regulates thyroid hormone (T3)-induced proliferative ERK1/2 signaling. Scientific Reports. 10 (1), 21918 (2020).
- Flecknell, P. . Laboratory Animal Anaesthesia. Third edition. , (2009).
- Iismaa, S. E., et al. Cardiac hypertrophy limits infarct expansion after myocardial infarction in mice. Scientific Reports. 8 (1), 6114 (2018).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- . Anesthesia and Analgesia: Neonatal Mice and Rats Available from: https://www.bu.edu/researchsupport/compliance/animal-care/working-with-animals/anesthesia/anesthesia-and-analgesia-neonatal-mice-and-rats-iacuc/ (2019)
- . Mouse-Specific Anesthesia Guidance Available from: https://research.utexas.edu/qpcontent/uploads/sites/7/2020/02/Mouse_Anesthesia_guidance_ARC_112519.pdf (2019)
- Paddleford, R. . Manual of Small Animal Anaesthesia. Second edition. , (2000).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Daubenspeck, J. A., Li, A., Nattie, E. E. Acoustic plethysmography measures breathing in unrestrained neonatal mice. Journal of Applied Physiology. 104 (1), 262-268 (2008).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. Journal of Visulaized Experiments. (90), e51755 (2014).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Du, X. -. J., Gao, X., Ramsey, D. Surgical methods of inducing transverse aortic stenosis and myocardial infarction in the mouse. Asia Pacific Heart Journal. 7 (3), 187-192 (1998).
- Wu, J., et al. Anesthesia and intubation of 10-Day old C57BL/6J mouse pups for cardiothoracic surgery. Research Square. , (2021).
- Silver, L. M. Mouse Genetics: Concepts and Applications. Mouse Genome Informatics, The Jackson Laboratory. , (2008).
- West, G. B., Woodruff, W. H., Brown, J. H. Allometric scaling of metabolic rate from molecules and mitochondria to cells and mammals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 2473-2478 (2002).
- Moscovitz, J. E., Aleksunes, L. M. Establishment of metabolism and transport pathways in the rodent and human fetal liver. International Journal of Molecular Science. 14 (12), 23801-23827 (2013).
- Blevins, C. E., Celeste, N. A., Marx, J. O. Effects of oxygen supplementation on injectable and inhalant anesthesia in C57BL/6 mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 60 (3), 289-297 (2021).
