Sammenhængende Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) ansøgning om billeddannelse myelinering i hjerneskiver
Summary
Visualisering af myelinering er et vigtigt mål for mange forskere, der studerer nervesystemet. CARS er en teknik, der er kompatibel med immunfluorescens, der naturligt kan afbilde lipider i væv som hjernen, der belyser specialiserede strukturer såsom myelin.
Abstract
Sammenhængende anti-Stokes Raman-spektroskopi (CARS) er en teknik, der klassisk anvendes af kemikere og fysikere til at producere et sammenhængende signal om signaturvibrationer af molekyler. Imidlertid er disse vibrationssignaturer også karakteristiske for molekyler inden for anatomisk væv som hjernen, hvilket gør det stadig mere nyttigt og anvendeligt til neurovidenskabelige applikationer. For eksempel kan CARS måle lipider ved specifikt spændende kemiske bindinger inden for disse molekyler, hvilket muliggør kvantificering af forskellige aspekter af væv, såsom myelin involveret i neurotransmission. Derudover kan CARS sammenlignet med andre teknikker, der typisk bruges til at kvantificere myelin, også indstilles til at være kompatible med immunfluorescerende teknikker, hvilket giver mulighed for co-mærkning med andre markører såsom natriumkanaler eller andre komponenter i synaptisk transmission. Myelineringsændringer er en iboende vigtig mekanisme i demyeliniserende sygdomme som multipel sklerose eller andre neurologiske tilstande såsom fragilt X syndrom eller autismespektrumforstyrrelser er et voksende forskningsområde. Afslutningsvis kan CARS bruges på innovative måder til at besvare presserende spørgsmål inden for neurovidenskab og give bevis for underliggende mekanismer relateret til mange forskellige neurologiske tilstande.
Introduction
Handlingspotentialer er den grundlæggende informationsenhed i hjernen, og handlingspotentialeudbredelse gennem axoner udgør en søjle i informationsbehandling 1,2,3. Neuroner modtager typisk afferente input fra flere andre neuroner og integrerer disse input inden for et givet smalt tidsvindue 4,5. Derfor har mekanismerne for handlingspotentiale formering i axoner fået en betydelig mængde opmærksomhed fra efterforskere.
Ved formering gennem en axon regenereres et handlingspotentiale gentagne gange langs axonen for at sikre pålidelig udbredelse6. I de fleste neuroner af kæbede hvirveldyr (gnathostomer) er axoner omgivet af en kappe af myelin, som er et lipidrigt stof produceret af nærliggende oligodendrocytter eller Schwann-celler, som er typer af gliaceller (gennemgået i 7,8). Denne myelinkappe isolerer axonen elektrisk, reducerer dens kapacitans og muliggør handlingspotentialeudbredelse effektivt, hurtigt og med lavere energiforbrug. Myelin dækker ikke axonen ensartet, men den kapper axonen i segmenter, der har korte mellemrum imellem dem, kaldet Ranviers knudepunkter (gennemgået i 9,10). Både myelineringstykkelse, som styrer niveauet for elektrisk isolering af en axon, og afstanden mellem Ranviers knuder, som styrer hyppigheden, hvormed handlingspotentialer regenereres langs en axon, påvirker hastigheden af handlingspotentialeudbredelse (gennemgået i11).
Der er en stor mængde litteratur, der tyder på, at myelineringstykkelse påvirker hastigheden af aktionspotentialeudbredelse i axoner12,13,14. Desuden kan ændringer i axonmyelinering resultere i en række CNS-underskud 15,16,17,18,19,20,21. Det er derfor ikke overraskende, at fokus for mange forskningsindsatser involverer måling og karakterisering af axonmyelinering. Målinger af myelintykkelse er oftest udført med elektronmikroskopi, en teknik, der kræver en betydelig mængde vævsforberedelse og er udfordrende at bruge i kombination med immunhistokemi. Der er dog også en hurtigere og enklere teknik til at måle axonmyelinering, der er baseret på Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS). En CARS-laser kan indstilles til forskellige frekvenser, og når den er indstillet til frekvenser, der er egnede til at ophidse lipider, kan myelin afbildes uden behov for yderligere etiketter22. Lipidbilleddannelsen kan kombineres med standard immunhistokemi, således at lipider kan afbildes sammen med flere fluorescerende kanaler23. Imaging myelinering med CARS er signifikant hurtigere end elektronmikroskopi og har en opløsning, der er, omend lavere end EM, tilstrækkelig til at detektere selv små forskelle i myelinering i samme type axoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
En voksende mængde litteratur understreger myelins rolle i hjernefunktionen 13,16,21,28. Desuden ved vi, at myelineringstykkelse og myelineringsmønster kan ændre sig i flere neurologiske tilstande såsom multipel sklerose (gennemgået i29), aldring (gennemgået i 30), autisme20,31 og mange andre.<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Understøttet af NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) og NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 og FRAXA (McCullagh). CARS-billeddannelsen blev udført i Advanced Light Microscopy Core-delen af NeuroTechnology Center ved University of Colorado Anschutz Medical Campus, delvist understøttet af NIH P30 NS048154 og NIH P30 DK116073.
Materials
| Anesthetic: | |||
| 1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5" | Exel int | 260040 | |
| Fatal + | Vortech | ||
| Surgery: | |||
| Spring Scissors – 8mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Perfusion: | |||
| 4% Paraformaldehyde | Fisher Chemical | SF994 (CS) | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Kelly hemostats | Fine Science Tools | 13019-14 | |
| Millipore H2O | |||
| Needle tip, 23 GA x 1" | BD precision glide | 305193 | |
| Phosphate buffered saline (PBS): | |||
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Potassium phosphate monobase | Sigma | P5655 | |
| pump with variable flow or equivalent | |||
| Sodium chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Sodiumphosphate dibasic | Sigma | S7907 | |
| Dissection: | |||
| 50 mL vial with 4% PFA | |||
| Bochem Chemical Spoon 180mm | Bochem | 230331000 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-20 | |
| Slicing: | |||
| Agar, plant | RPI | 9002-18-0 | |
| Vibratome | Leica | VT1000s | |
| well plate | Alkali Sci. | TPN1048-NT | |
| Staining: | |||
| AB Media: | 1n 1,000 mL of Millipore H2O | ||
| Phosphate buffered (PB): | |||
| Potassium Phosphate Monobase | Sigma | P5655 | |
| Sodium Phosohate Dibasic | Sigma | S7907 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma life science | A2153-100g | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Triton X-100 | Sigma – Aldrich | x100-500ml | |
| Nissl 435/455 | Invitrogen | N21479 | |
| CARS: | |||
| APE picoemerald laser | Angewandte Physik & Elektronik GmbH | ||
| bandpass filter (420-520 nm) | Chroma Technology | HQ470/100m-2P | |
| bandpass filter (500-530 nm) | Chroma Technology | HQ515/30m-2P | |
| bandpass filters (640-680 nm) | Chroma Technology | HQ660/40m-2P | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Cut Transfer pipet | Fisher | 13-711-7M | |
| dichroic longpass 565 nm | Chroma Technology | 565dcxr | |
| dichroic longpass 585 nm | Chroma Technology | 585dcxr | |
| dichroic shortpass 750 nm | Chroma Technology | T750spxrxt | |
| glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-10-C | |
| glass weight (10 mm x 10 mm boro rod) | Allen Scientific Glass Inc | ||
| multiphoton shortpass emission filter 680 nm | Chroma Technology | ET680sp-2p8 | |
| PBS |
References
- Cole, K., Curtis, H. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
- Cole, K. S., Curtis, H. J. Membrane potential of the squid giant axon during current flow. Journal of General Physiology. 24 (4), 551-563 (1941).
- Alcami, P., El Hady, A. Axonal computations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 413 (2019).
- Neumann, E., Nachmansohn, D. Nerve excitability-Toward an integrating concept. Aharon Katzir Memorial Volume. , 99-166 (1975).
- Waxman, S. G. Integrative properties and design principles of axons. International Review of Neurobiology. 18, 1-40 (1975).
- Fitzhugh, R. Computation of impulse initiation and saltatory conduction in a myelinated nerve fiber. Biophysical Journal. 2 (1), 11-21 (1962).
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 275-281 (2006).
- Salzer, J. L., Zalc, B. Myelination. Current Biology. 26 (20), 971-975 (2016).
- Boullerne, A. I. The history of myelin. Experimental Neurology. 283, 431-445 (2016).
- Kuhn, S., Gritti, L., Crooks, D., Dombrowski, Y. Oligodendrocytes in development, myelin generation and beyond. Cells. 8 (11), 1424 (2019).
- Saab, A. S., Nave, K. -. A. Myelin dynamics: protecting and shaping neuronal functions. Current Opinion in Neurobiology. 47, 104-112 (2017).
- Chomiak, T., Hu, B. What is the optimal value of the g-Ratio for myelinated fibers in the rat CNS? A theoretical approach. PLOS ONE. 4 (11), 7754 (2009).
- Ford, M. C., et al. Tuning of Ranvier node and internode properties in myelinated axons to adjust action potential timing. Nature Communications. 6, 8073 (2015).
- Stange-Marten, A., et al. Input timing for spatial processing is precisely tuned via constant synaptic delays and myelination patterns in the auditory brainstem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), 4851-4858 (2017).
- Bu, J., Banki, A., Wu, Q., Nishiyama, A. Increased NG2+ glial cell proliferation and oligodendrocyte generation in the hypomyelinating mutant shiverer. Glia. 48 (1), 51-63 (2004).
- Pacey, L. K. K., et al. Delayed myelination in a mouse model of fragile X syndrome. Human Molecular Genetics. 22 (19), 3920-3930 (2013).
- Green, A. J., et al. Clemastine fumarate as a remyelinating therapy for multiple sclerosis (ReBUILD): a randomised, controlled, double-blind, crossover trial. Lancet. 390 (10111), 2481-2489 (2017).
- Jeon, S. J., Ryu, J. H., Bahn, G. H. Altered translational control of fragile X mental retardation protein on myelin proteins in neuropsychiatric disorders. Biomolecules & Therapeutics. 25 (3), 231-238 (2017).
- Barak, B., et al. Neuronal deletion of Gtf2i, associated with Williams syndrome, causes behavioral and myelin alterations rescuable by a remyelinating drug. Nature Neuroscience. 22 (5), 700-708 (2019).
- Phan, B. N., et al. A myelin-related transcriptomic profile is shared by Pitt-Hopkins syndrome models and human autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 23 (3), 375-385 (2020).
- Lucas, A., Poleg, S., Klug, A., McCullagh, E. A. Myelination deficits in the auditory brainstem of a mouse model of fragile X syndrome. Frontiers in Neuroscience. 15, 1536 (2021).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. -. X. Coherent anti-stokes raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal ttissues. Biophysical Journal. 89 (1), 581-591 (2005).
- Kim, S. -. H., et al. Multiplex coherent anti-stokes raman spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids. Circulation Research. 106 (8), 1332-1341 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Tu, L., et al. Free-floating Immunostaining of Mouse Brains. Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).
- . Fluorescence SpectraViewer Available from: https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer (2022)
- Held, H. Die centrale gehörleitung. Arch Anat Physiol Anat Abt. 17, 201-248 (1893).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Gruchot, J., et al. The molecular basis for remyelination failure in multiple sclerosis. Cells. 8 (8), 825 (2019).
- Rivera, A. D., et al. Epidermal growth factor pathway in the age-related decline of oligodendrocyte regeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 838007 (2022).
- Kútna, V., O’Leary, V. B., Hoschl, C., Ovsepian, S. V. Cerebellar demyelination and neurodegeneration associated with mTORC1 hyperactivity may contribute to the developmental onset of autism-like neurobehavioral phenotype in a rat model. Autism Research: Official Journal of the International Society for Autism Research. 15 (5), 791-805 (2022).
- Ozsvár, A., et al. Quantitative analysis of lipid debris accumulation caused by cuprizone induced myelin degradation in different CNS areas. Brain Research Bulletin. 137, 277-284 (2018).
- Prineas, J. W., Graham, J. S. Multiple sclerosis: capping of surface immunoglobulin G on macrophages engaged in myelin breakdown. Annals of Neurology. 10 (2), 149-158 (1981).
- Bégin, S., et al. Automated method for the segmentation and morphometry of nerve fibers in large-scale CARS images of spinal cord tissue. Biomedical Optics Express. 5 (12), 4145-4161 (2014).
