뇌 조각의 수초화 이미징을 위한 일관된 안티-스톡스 라만 분광법(CARS) 애플리케이션
Summary
수초화를 시각화하는 것은 신경계를 연구하는 많은 연구자들에게 중요한 목표입니다. CAS는 미엘린과 같은 특수 구조를 조명하는 뇌와 같은 조직 내에서 지질을 기본적으로 이미지화할 수 있는 면역형광법과 호환되는 기술입니다.
Abstract
일관된 안티 스톡스 라만 분광법(CARS)은 화학자와 물리학자가 분자의 시그니처 진동에 대한 일관된 신호를 생성하기 위해 고전적으로 사용하는 기술입니다. 그러나 이러한 진동 신호는 뇌와 같은 해부학 적 조직 내의 분자의 특성이기도하므로 신경 과학 응용 분야에 점점 더 유용하고 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, CARS는 이러한 분자 내의 화학 결합을 특이적으로 여기시켜 지질을 측정할 수 있으므로 신경 전달에 관여하는 미엘린과 같은 조직의 다양한 측면을 정량화할 수 있습니다. 또한, 미엘린을 정량화하기 위해 전형적으로 사용되는 다른 기술과 비교하여, CARS는 또한 면역형광 기술과 호환되도록 설정될 수 있어서, 나트륨 채널 또는 시냅스 전달의 다른 성분과 같은 다른 마커와의 공동 표지를 허용한다. 수초화 변화는 다발성 경화증과 같은 탈수초성 질환 또는 취약 X 증후군 또는 자폐 스펙트럼 장애와 같은 기타 신경학적 상태에서 본질적으로 중요한 메커니즘이 새로운 연구 분야입니다. 결론적으로, CARS는 신경 과학의 긴급한 질문에 답하고 다양한 신경 학적 상태와 관련된 기본 메커니즘에 대한 증거를 제공하기 위해 혁신적인 방법으로 활용 될 수 있습니다.
Introduction
활동 전위는 뇌에서 정보의 기본 단위이며, 축삭을 통한 활동 전위 전파는 정보 처리의 한 기둥을 형성합니다 1,2,3. 뉴런은 전형적으로 다수의 다른 뉴런으로부터 구심성 입력을 수신하고, 주어진 좁은 시간 윈도우 내에 이들 입력을 통합한다(4,5). 따라서 축삭의 활동 전위 전파 메커니즘은 연구자로부터 상당한 관심을 받았습니다.
축삭을 통해 전파 될 때, 활동 전위는 축삭을 따라 반복적으로 재생되어 안정적인 전파를 보장합니다6. 턱이있는 척추 동물 (gnathostomes)의 대부분의 뉴런에서 축삭은 신경교 세포의 유형 인 근처의 희소 돌기 아교 세포 또는 Schwann 세포에서 생성되는 지질이 풍부한 물질 인 미엘린 덮개로 둘러싸여 있습니다 (7,8에서 검토). 이 myelin sheath는 축삭을 전기적으로 절연하여 커패시턴스를 줄이고 활동 전위 전파를 효율적이고 빠르며 낮은 에너지 소비로 허용합니다. Myelin은 축삭을 균일하게 덮지 않지만 Ranvier의 노드라고 하는 축삭 사이에 짧은 간격이 있는 부분으로 축삭을 덮습니다(9,10에서 검토됨). 축삭의 전기 절연 수준을 제어하는 수초화 두께와 축삭을 따라 활동 전위가 재생되는 빈도를 제어하는 Ranvier 노드의 간격은 활동 전위 전파 속도에 영향을 미칩니다 (11에서 검토).
수초화 두께가 축삭12,13,14에서 활동 전위 전파 속도에 영향을 미친다는 것을 시사하는 많은 문헌이 있습니다. 더욱이, 축삭 수초화의 변화는 다수의 CNS 결핍 15,16,17,18,19,20,21을 초래할 수 있다. 따라서 많은 연구 노력의 초점이 축삭 수초화의 측정 및 특성화를 포함한다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 미엘린 두께의 측정은 전자 현미경으로 가장 일반적으로 수행되었으며, 이는 상당한 양의 조직 준비가 필요하고 면역 조직 화학과 함께 사용하기가 어려운 기술입니다. 그러나 코히어런트 안티-스톡스 라만 분광법(CARS)을 기반으로 하는 축삭 수초화를 측정하는 더 빠르고 간단한 기술도 있습니다. CARS 레이저는 다양한 주파수로 튜닝될 수 있고, 지질을 여기시키기에 적합한 주파수로 튜닝될 때, 미엘린은 임의의 추가 라벨(22)에 대한 필요 없이 이미지화될 수 있다. 지질 영상화는 표준 면역조직화학과 조합될 수 있어서, 지질은 몇몇 형광 채널(23)과 함께 영상화될 수 있다. CARS를 사용한 이미징 수초화는 전자 현미경보다 훨씬 빠르며 EM보다 낮지 만 동일한 유형의 축삭에서 수초화의 작은 차이도 감지하기에 충분한 분해능을 가지고 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
점점 더 많은 문헌이 뇌 기능에서 미엘린의 역할을 강조합니다 13,16,21,28. 또한, 우리는 수초 두께와 수초 패턴이 다발성 경화증 (29 년 검토), 노화 (30 년 검토), 자폐증20,31 및 기타 여러 가지 신경 학적 상태에서 변할 수 있음을 알고 있습니…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) 및 NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 및 FRAXA (McCullagh)에서 지원합니다. CARS 이미징은 NIH P30 NS048154 및 NIH P30 DK116073에 의해 부분적으로 지원되는 콜로라도 대학교 Anschutz Medical Campus의 신경 기술 센터의 Advanced Light Microscopy Core 부분에서 수행되었습니다.
Materials
| Anesthetic: | |||
| 1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5" | Exel int | 260040 | |
| Fatal + | Vortech | ||
| Surgery: | |||
| Spring Scissors – 8mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Perfusion: | |||
| 4% Paraformaldehyde | Fisher Chemical | SF994 (CS) | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Kelly hemostats | Fine Science Tools | 13019-14 | |
| Millipore H2O | |||
| Needle tip, 23 GA x 1" | BD precision glide | 305193 | |
| Phosphate buffered saline (PBS): | |||
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Potassium phosphate monobase | Sigma | P5655 | |
| pump with variable flow or equivalent | |||
| Sodium chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Sodiumphosphate dibasic | Sigma | S7907 | |
| Dissection: | |||
| 50 mL vial with 4% PFA | |||
| Bochem Chemical Spoon 180mm | Bochem | 230331000 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-20 | |
| Slicing: | |||
| Agar, plant | RPI | 9002-18-0 | |
| Vibratome | Leica | VT1000s | |
| well plate | Alkali Sci. | TPN1048-NT | |
| Staining: | |||
| AB Media: | 1n 1,000 mL of Millipore H2O | ||
| Phosphate buffered (PB): | |||
| Potassium Phosphate Monobase | Sigma | P5655 | |
| Sodium Phosohate Dibasic | Sigma | S7907 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma life science | A2153-100g | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Triton X-100 | Sigma – Aldrich | x100-500ml | |
| Nissl 435/455 | Invitrogen | N21479 | |
| CARS: | |||
| APE picoemerald laser | Angewandte Physik & Elektronik GmbH | ||
| bandpass filter (420-520 nm) | Chroma Technology | HQ470/100m-2P | |
| bandpass filter (500-530 nm) | Chroma Technology | HQ515/30m-2P | |
| bandpass filters (640-680 nm) | Chroma Technology | HQ660/40m-2P | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Cut Transfer pipet | Fisher | 13-711-7M | |
| dichroic longpass 565 nm | Chroma Technology | 565dcxr | |
| dichroic longpass 585 nm | Chroma Technology | 585dcxr | |
| dichroic shortpass 750 nm | Chroma Technology | T750spxrxt | |
| glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-10-C | |
| glass weight (10 mm x 10 mm boro rod) | Allen Scientific Glass Inc | ||
| multiphoton shortpass emission filter 680 nm | Chroma Technology | ET680sp-2p8 | |
| PBS |
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