Aplicação coerente de espectroscopia Raman anti-Stokes (CARS) para mielinização por imagem em fatias cerebrais

Summary

Visualizar a mielinização é um objetivo importante para muitos pesquisadores que estudam o sistema nervoso. CARS é uma técnica compatível com a imunofluorescência que pode fotografar nativamente lipídios dentro do tecido, como o cérebro, iluminando estruturas especializadas, como a mielina.

Abstract

A espectroscopia Raman anti-Stokes coerente (CARS) é uma técnica classicamente empregada por químicos e físicos para produzir um sinal coerente de vibrações de assinatura de moléculas. No entanto, essas assinaturas vibracionais também são características de moléculas dentro do tecido anatômico, como o cérebro, tornando-o cada vez mais útil e aplicável para aplicações de Neurociência. Por exemplo, o CARS pode medir lipídios por ligações químicas especificamente excitantes dentro dessas moléculas, permitindo a quantificação de diferentes aspectos do tecido, como a mielina envolvida na neurotransmissão. Além disso, em comparação com outras técnicas tipicamente usadas para quantificar a mielina, o CARS também pode ser configurado para ser compatível com técnicas de imunofluorescência, permitindo a co-marcação com outros marcadores, como canais de sódio ou outros componentes da transmissão sináptica. As alterações da mielinização são um mecanismo inerentemente importante em doenças desmielinizantes, como a esclerose múltipla ou outras condições neurológicas, como a Síndrome do X Frágil ou os transtornos do espectro do autismo, é uma área emergente de pesquisa. Em conclusão, o CARS pode ser utilizado de maneiras inovadoras para responder a questões prementes em Neurociência e fornecer evidências de mecanismos subjacentes relacionados a muitas condições neurológicas diferentes.

Introduction

Os potenciais de ação são a unidade básica de informação no cérebro, e a propagação do potencial de ação através dos axônios constitui um pilar do processamento da informação ^1,2,3. Os neurônios normalmente recebem entradas aferentes de vários outros neurônios e integram essas entradas dentro de uma determinada janela de tempo estreita ^4,5. Portanto, os mecanismos de propagação do potencial de ação nos axônios têm recebido uma quantidade significativa de atenção dos pesquisadores.

Ao se propagar através de um axônio, um potencial de ação é regenerado repetidamente ao longo do axônio para garantir uma propagação confiável⁶. Na maioria dos neurônios de vertebrados mandibulares (gnatohostomas) os axônios são cercados por uma bainha de mielina, que é uma substância rica em lipídios produzida por oligodendrócitos próximos ou células de Schwann, que são tipos de células gliais (revisadas em ^7,8). Esta bainha de mielina isola eletricamente o axônio, reduzindo sua capacitância e permitindo a propagação do potencial de ação de forma eficiente, rápida e com menor consumo de energia. A mielina não cobre o axônio uniformemente, mas revestia o axônio em segmentos que têm lacunas curtas entre eles, chamados de nós de Ranvier (revisado em ^9,10). Tanto a espessura da mielinização, que controla o nível de isolamento elétrico de um axônio, quanto o espaçamento dos nós de Ranvier, que controlam a frequência com que os potenciais de ação são regenerados ao longo de um axônio, influenciam a velocidade de propagação do potencial de ação (revisado em¹¹).

Há um grande corpo de literatura sugerindo que a espessura da mielinização afeta a velocidade de propagação do potencial de ação em axônios^12,13,14. Além disso, alterações na mielinização axônica podem resultar em vários déficits do SNC 15,16,17,18,19,20,21. Portanto, não é surpreendente que o foco de muitos esforços de pesquisa envolva a medição e caracterização da mielinização axônica. As medições da espessura da mielina têm sido mais comumente feitas com microscopia eletrônica, uma técnica que requer uma quantidade significativa de preparação tecidual e é difícil de usar em combinação com a imuno-histoquímica. No entanto, existe também uma técnica mais rápida e simples para medir a mielinização axônica que é baseada na Espectroscopia Raman Anti-Stokes Coerente (CARS). Um laser CARS pode ser sintonizado em várias frequências e, quando sintonizado em frequências adequadas para excitar lipídios, a mielina pode ser fotografada sem a necessidade de rótulos adicionais²². A imagem lipídica pode ser combinada com imuno-histoquímica padrão, de modo que os lipídios possam ser fotografados juntamente com vários canais fluorescentes²³. A mielinização por imagem com CARS é significativamente mais rápida do que a microscopia eletrônica e tem uma resolução que é, embora menor que a EM, suficiente para detectar até mesmo pequenas diferenças na mielinização no mesmo tipo de axônios.

Protocol

Todos os experimentos cumpriram todas as leis aplicáveis, diretrizes do National Institutes of Health e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Colorado em Anschutz. 1. Animais Use camundongos C57BL/6J (estoque #000664) (Mus musculus ) obtidos do Laboratório Jackson ou gerbilos mongóis (Meriones unguiculatus) originalmente obtidos do rio Charles. 2. Prepara…

Representative Results

Uma das maiores vantagens da microscopia CARS em relação a outras técnicas é a compatibilidade com imagens fluorescentes23. A Figura 1 mostra os espectros CARS em comparação com o Nissl marcado com marcador imunofluorescente mostrando pouca ou nenhuma sobreposição nos espectros. A Figura 2 ilustra a configuração do laser para o CARS em combinação com a microscopia confocal. A Figura 3 demonstra du…

Discussion

Um crescente corpo de literatura enfatiza o papel da mielina na função cerebral 13,16,21,28. Além disso, sabemos que a espessura da mielinização e o padrão de mielinização podem mudar em várias condições neurológicas, como esclerose múltipla (revisada em²⁹), envelhecimento (revisada em^{30), autismo 20,31</s…}

Materials

Anesthetic:
1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5"	Exel int	260040
Fatal +	Vortech
Surgery:
Spring Scissors – 8mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15024-10
Standard tweezers	Fine Science Tools	11027-12
Perfusion:
4% Paraformaldehyde	Fisher Chemical	SF994 (CS)
Fine Scissors – Sharp	Fine Science Tools	14063-11
Kelly hemostats	Fine Science Tools	13019-14
Millipore H2O
Needle tip, 23 GA x 1"	BD precision glide	305193
Phosphate buffered saline (PBS):
Potassium chloride	Sigma	P9333
Potassium phosphate monobase	Sigma	P5655
pump with variable flow or equivalent
Sodium chloride	Fisher Chemical	s271-1
Sodiumphosphate dibasic	Sigma	S7907
Dissection:
50 mL vial with 4% PFA
Bochem Chemical Spoon 180mm	Bochem	230331000
Fine Scissors – Sharp	Fine Science Tools	14063-11
Noyes Spring Scissors	Fine Science Tools	15011-12
Pair of fine (Graefe) tweezers	Fine Science Tools	11050-10
Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10"
Standard tweezers	Fine Science Tools	11027-12
Surgical Scissors – Blunt	Fine Science Tools	14000-20
Slicing:
Agar, plant	RPI	9002-18-0
Vibratome	Leica	VT1000s
well plate	Alkali Sci.	TPN1048-NT
Staining:
AB Media:			1n 1,000 mL of Millipore H2O
Phosphate buffered (PB):
Potassium Phosphate Monobase	Sigma	P5655
Sodium Phosohate Dibasic	Sigma	S7907
BSA (Bovine serum albumin)	Sigma life science	A2153-100g
Sodium Chloride	Fisher Chemical	s271-1
Triton X-100	Sigma – Aldrich	x100-500ml
Nissl 435/455	Invitrogen	N21479
CARS:
APE picoemerald laser	Angewandte Physik & Elektronik GmbH
bandpass filter (420-520 nm)	Chroma Technology	HQ470/100m-2P
bandpass filter (500-530 nm)	Chroma Technology	HQ515/30m-2P
bandpass filters (640-680 nm)	Chroma Technology	HQ660/40m-2P
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Cut Transfer pipet	Fisher	13-711-7M
dichroic longpass 565 nm	Chroma Technology	565dcxr
dichroic longpass 585 nm	Chroma Technology	585dcxr
dichroic shortpass 750 nm	Chroma Technology	T750spxrxt
glass bottom culture dish	MatTek	P35G-0-10-C
glass weight (10 mm x 10 mm boro rod)	Allen Scientific Glass Inc
multiphoton shortpass emission filter 680 nm	Chroma Technology	ET680sp-2p8
PBS