Здесь представлен протокол для создания сухих макропористых альгинатных каркасов, которые опосредуют эффективный перенос вирусных генов для использования в генной инженерии Т-клеток, включая Т-клетки для терапии CAR-T-клетками. Было показано, что каркасы трансдуцируют активированные первичные Т-клетки с трансдукцией >85%.
Генная инженерия Т-клеток для терапии CAR-T-клетками вышла на передний план лечения рака за последние несколько лет. CAR-T-клетки продуцируются путем переноса вирусных генов в Т-клетки. Нынешний золотой стандарт переноса вирусных генов включает в себя спинокуляцию пластин с ретронектиновым покрытием, что является дорогостоящим и трудоемким. Существует значительная потребность в эффективных и экономичных методах получения CAR-T-клеток. Здесь описан метод изготовления недорогих, сухих макропористых альгинатных каркасов, известных как каркасы Drydux, которые эффективно способствуют вирусной трансдукции активированных Т-клеток. Каркасы предназначены для использования вместо золотого стандарта спинокуляции пластин с ретронектиновым покрытием, засеянных вирусом, и упрощают процесс преобразования клеток. Альгинат сшивается с кальцием-D-глюконатом и замораживается на ночь для создания каркасов. Замороженные каркасы лиофилизируют в лиофилизаторе в течение 72 ч, чтобы завершить формирование сухих макропористых каркасов. Каркасы опосредуют перенос вирусных генов, когда вирусные и активированные Т-клетки сеются вместе поверх каркаса для производства генетически модифицированных клеток. Каркасы производят >85% первичной трансдукции Т-клеток, что сопоставимо с эффективностью трансдукции спинокуляции на пластинах, покрытых ретронектином. Эти результаты демонстрируют, что сухие макропористые альгинатные каркасы служат более дешевой и удобной альтернативой традиционному методу трансдукции.
Иммунотерапия стала революционной парадигмой лечения рака из-за ее способности специфически нацеливаться на опухоли, ограничивать нецелевую цитотоксичность и предотвращать рецидив. В частности, клеточная терапия химерным антигенным рецептором Т (CAR-T) приобрела популярность благодаря ее успеху в лечении лимфом и лейкемий. FDA одобрило первую терапию CAR-T-клетками в 2017 году, и с тех пор одобрило еще четыре CAR-T клеточныетерапии 1,2,3,4,5. CARs имеют домен распознавания антигена, обычно состоящий из одного цепного переменного фрагмента моноклонального антитела, который является специфическим для опухолевого ассоциированного антигена 3,4. Когда CAR взаимодействует со своим опухолеассоциированным антигеном, CAR-T-клетки активируются, что приводит к противоопухолевому ответу, включающему высвобождение цитокинов, цитолитическую дегрануляцию, экспрессию фактора транскрипции и пролиферацию Т-клеток. Для производства CAR-T-клеток кровь собирается у пациента для получения их Т-клеток. CARs генетически добавляются к Т-клеткам пациента с помощью вируса. CAR-T-клетки выращивают in vitro и вводят обратно пациенту 2,3,4,6. Успешная генерация CAR-T-клеток определяется эффективностью трансдукции, которая описывает количество Т-клеток, которые генетически модифицированы в CAR-T-клетки.
В настоящее время золотым стандартом генерации CAR-T-клеток является спинокуляция активированных Т-клеток и вируса на пластинахс ретронектиновым покрытием 7,8. Трансдукция начинается, когда вирусные частицы взаимодействуют с поверхностью Т-клеток. Ретронектин способствует колокализации вируса и клеток за счет повышения эффективности связывания между вирусными частицами и клетками, усиливая трансдукцию 7,8. Ретронектин плохо работает сам по себе и должен сопровождаться спинокуляцией, которая усиливает перенос генов путем концентрации вирусных частиц и увеличения поверхностной проницаемости Т-клеток, что облегчает вирусную инфекцию8. Несмотря на успех спинокуляции на пластинах с ретронектиновым покрытием, это сложный процесс, который требует нескольких циклов вращения и дорогостоящих реагентов. Поэтому альтернативные методы переноса вирусных генов, которые являются более быстрыми и дешевыми, очень желательны.
Альгинат является природным анионным полисахаридом, широко используемым в биомедицинской промышленности из-за его низкой стоимости, хорошего профиля безопасности и способности образовывать гидрогели при смешивании с двухвалентными катионами 9,10,11,12. Альгинат является GMP-совместимым полимером и в целом признан безопасным (GRAS) FDA13. Сшивание альгината с катионами создает стабильные гидрогели, часто используемые для заживления ран, доставки небольших химических препаратов и белков и транспортировки клеток 9,10,11,12,14,15,16. Благодаря своим превосходным гелеобразующим свойствам, альгинат является предпочтительным материалом для создания пористых каркасов путем сублимационной сушки10,17. Эти характеристики альгината делают его привлекательным кандидатом для производства каркаса, который может опосредуть перенос вирусных генов активированных клеток.
Здесь описан протокол для создания сухих макропористых альгинатных каркасов, известных как каркасы Drydux, которые статически трансдуцируют Т-клетки путем переноса вирусных генов17,18. Процесс изготовления этих каркасов показан на рисунке 1. Эти каркасы устраняют необходимость в спинокуляции пластин с ретронектиновым покрытием. Макропористые альгинатные каркасы стимулируют взаимодействие вирусных частиц и Т-клеток, чтобы обеспечить эффективный перенос генов за один этап, не влияя на функциональность и жизнеспособность инженерных Т-клеток17. При правильном следовании эти макропористые альгинатные каркасы имеют эффективность трансдукции не менее 80%, упрощая и укорачивая процесс вирусной трансдукции.
Рисунок 1: Схема и временная шкала протокола. (A) Временная шкала для создания сухих макропористых альгинатных каркасов. Альгинат сшивается с кальцием-D-глюконатом и замораживается на ночь. Замороженные каркасы лиофилизируются в течение 72 ч, чтобы создать каркасы Drydux. (B) Временная шкала для вирусной трансдукции активированных клеток. Активированные клетки и вирус (MOI 2) высеивают поверх каркаса и инкубируют в полной среде, дополненной IL-7 и IL-15. Каркасы поглощают смесь и способствуют переносу вирусных генов. ЭДТА используется для растворения каркасов и изоляции трансдуцированных клеток. После двойной промывки PBS гранулу ячейки можно использовать для анализа. Сокращения: PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; PBMCs = мононуклеарные клетки периферической крови. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
CAR-T-клеточная терапия продолжает вызывать интерес как для исследований, так и для коммерческих применений. Несмотря на успех CAR-T-клеточной терапии в лечении рака крови, высокая стоимость процедуры ограничивает ее использование. Представленный здесь протокол вводит новый метод перенос…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения через номера грантов R37-CA260223, R21CA246414. Мы благодарим ядро проточной цитометрии NCSU за обучение и руководство по анализу проточной цитометрии. Схемы были созданы с помощью Biorender.com
0.5 M EDTA | Invitrogen | 15575-038 | UltraPure, pH 8.0 |
1x DPBS | Gibco | 14190-144 | No calcium chloride or magnesium chloride |
3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies Inc | 07060 | |
Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells | – | – | Fresh or frozen |
Calcium-D-Gluconate | Alfa Aesar | A11649 | |
CD28.2 Antibody | BD | 555725 | 1 mg/mL |
CD3 Antibody | Miltenyi | 130-093-387 | 100 μg/mL |
Click's Media | FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS | 9195 | |
DI Water | – | – | |
Glutamax | Gibco | 35-050-061 | |
HyClone FBS | Cytvia | SH3039603 | |
HyClone RPMI 1640 Media | Cytvia | SH3009601 | |
Penicillin-streptomycin (P/S) | Gibco | 15-140-122 | |
Peripheral Blood Mononuclear Cells | – | – | Fresh or frozen |
PRONOVA UP MVG | NovaMatrix | 4200101 | Sodium alginate |
Recombinant Human IL-15 | Peprotech | 200-15 | 5 ng/mL |
Recombinant Human IL-7 | Peprotech | 200-07 | 10 ng/mL |
Retrovirus | – | – | 1 x 106 TU/mL |