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Neuroscience

ड्यूटेरियम-एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री शारीरिक स्थितियों के तहत अल्फा-सिन्यूक्लिन संरचनात्मक गतिशीलता के अध्ययन के लिए

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/64050
Automatic Translation
1, 1
1Living Systems Institute, Department of Biosciences, University of Exeter

Summary

मोनोमेरिक अल्फा-सिन्यूक्लिन का संरचनात्मक पहनावा इसके शारीरिक कार्य और भौतिक रासायनिक गुणों को प्रभावित करता है। वर्तमान प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि शारीरिक परिस्थितियों में इस आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन के मोनोमर पर रचनात्मक जानकारी निर्धारित करने के लिए मिलीसेकंड हाइड्रोजन / ड्यूटेरियम-एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री और बाद के डेटा विश्लेषण कैसे करें।

Abstract

अल्फा-सिन्यूक्लिन (एएसवाईएन) एक आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन है जिसका फाइब्रिलर समुच्चय लेवी निकायों और न्यूराइट्स में प्रचुर मात्रा में होता है, जो पार्किंसंस रोग की पहचान हैं। फिर भी, इसकी अधिकांश जैविक गतिविधि, साथ ही इसके एकत्रीकरण में प्रोटीन का घुलनशील मोनोमर रूप शामिल है। एएसवाईएन जीव विज्ञान और पैथोफिजियोलॉजी के आणविक तंत्र की व्याख्या के लिए संरचनात्मक रूप से अत्यधिक हल किए गए तरीकों की आवश्यकता होती है और जैविक स्थितियों के प्रति संवेदनशील होता है। इसकी मूल रूप से प्रकट, मेटा-स्थिर संरचनाएं मोनोमेरिक एसिन को कई संरचनात्मक जीव विज्ञान तकनीकों के लिए असभ्य बनाती हैं। यहां, इस तरह के एक दृष्टिकोण के आवेदन का वर्णन किया गया है: कम थर्मोडायनामिक स्थिरता और कमजोर सुरक्षा कारकों, जैसे कि एसिन के साथ प्रोटीन के अध्ययन के लिए मिलीसेकंड टाइमस्केल पर हाइड्रोजन / मिलीसेकंड टाइमस्केल पर, एचडीएक्स-एमएस डेटा में एसिन की विलायक पहुंच और हाइड्रोजन-बंधुआ संरचना के बारे में जानकारी होती है, जो लंबे समय तक लेबलिंग समय पर खो जाती है, अंततः अमीनो एसिड स्तर तक संरचनात्मक संकल्प उत्पन्न करती है। इसलिए, एचडीएक्स-एमएस विरूपण गतिशीलता और थर्मोडायनामिक्स, इंट्रा- और इंटर-आणविक इंटरैक्शन, और पर्यावरणीय परिस्थितियों में उत्परिवर्तन या परिवर्तन के संरचनात्मक प्रभाव पर उच्च संरचनात्मक और लौकिक संकल्पों पर जानकारी प्रदान कर सकता है। मोटे तौर पर लागू होने पर, यह प्रदर्शित किया जाता है कि मोनोमेरिक एसिन में मिलीसेकंड एचडीएक्स-एमएस माप कैसे प्राप्त, विश्लेषण और व्याख्या करें।

Introduction

पार्किंसंस रोग (पीडी) एक न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारी है जो दुनिया भर में लाखों लोगों को प्रभावित करतीहै 1. यह साइटोप्लाज्मिक समावेशन के गठन की विशेषता है जिसे मस्तिष्क के मूल नाइग्रा पार्स कॉम्पैक्टा क्षेत्र में लेवी निकायों और लेवी न्यूराइट्स के रूप में जाना जाता है। इन साइटोप्लाज्मिक समावेशनों में आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन एसिन2 के समुच्चय पाए गए हैं। पीडी और अन्य सिन्यूक्लिनोपैथी में, एएसवाईएन घुलनशील अव्यवस्थित अवस्था से एक अघुलनशील, अत्यधिक संरचित रोगग्रस्त अवस्था में बदल जाता है। अपने मूल रूप में, मोनोमेरिक एसिन अपने एन- और सी-टर्मिनी के बीच लंबी दूरी के इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन और इसके सी-टर्मिनस और गैर-एमिलॉयड बीटा घटक (एनएसी) क्षेत्र 3,4,5,6 के बीच हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन द्वारा स्थिर रचनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला को गोद लेता है। उन स्थिर इंटरैक्शन में कोई भी व्यवधान, जैसे उत्परिवर्तन, पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन, और स्थानीय वातावरण में परिवर्तन, मोनोमर के मिसफोल्डिंग का कारण बन सकता है, इस प्रकार एकत्रीकरण7 की प्रक्रिया को ट्रिगर कर सकता है।

जबकि एएसवाईएन 8,9,10,11 के ओलिगोमेरिक और फाइब्रिलर रूपों पर बड़ी मात्रा में शोध मौजूद है, प्रोटीन के मोनोमेरिक रूप का अध्ययन करने और बेहतर ढंग से समझने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है कि कौन से अनुरूप कार्यात्मक हैं (और कैसे) और जो कुल 8,9,10,11 से ग्रस्त हैं . आंतरिक रूप से अव्यवस्थित होने के नाते, आकार में केवल 14 केडीए, और क्रिस्टलीकृत करना मुश्किल है, एएसवाईएन मोनोमर अधिकांश संरचनात्मक जैविक तकनीकों के लिए उत्तरदायी नहीं है। हालांकि, मोनोमेरिक एसिन की रचनात्मक गतिशीलता को मापने में सक्षम एक तकनीक मिलीसेकंड एचडीएक्स-एमएस है, जिसने हाल ही में महत्वपूर्ण संरचनात्मक टिप्पणियां उत्पन्न की हैं जो अन्यथा12,13,14 प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण या असंभव होगा। मिलीसेकंड एचडीएक्स-एमएस संवेदनशील रूप से एमाइड हाइड्रोजन पर आइसोटोपिक एक्सचेंज की निगरानी करके प्रोटीन विरूपण पहनावा के औसत को मापता है, जो मिलीसेकंड टाइमस्केल पर एक विशेष प्रोटीन क्षेत्र की विलायक पहुंच और हाइड्रोजन-बॉन्डिंग नेटवर्क भागीदारी का संकेत देता है। एचडीएक्स-एमएस के मिलीसेकंड पहलू पर जोर देना आवश्यक है, क्योंकि इसकी मूल रूप से प्रकट, मेटा-स्थिर प्रकृति के कारण, एएसवाईएन बहुत तेजी से हाइड्रोजन-एक्सचेंज कैनेटीक्स प्रदर्शित करता है जो पारंपरिक एचडीएक्स-एमएस सिस्टम की निचली सीमा से नीचे अच्छी तरह से प्रकट होता है। उदाहरण के लिए, अधिकांश एएसवाईएन अणु ने 1 एस से कम समय में इंट्रासेल्युलर स्थितियों के तहत ड्यूटेरियम के लिए हाइड्रोजन का पूरी तरह से आदान-प्रदान किया है। कई प्रयोगशालाओं ने अब तेजी से मिश्रण इंस्ट्रूमेंटेशन का निर्माण किया है; इस मामले में, 50 एमएस के मृत समय के साथ एचडीएक्स-एमएस करने में सक्षम एक प्रोटोटाइप फास्ट-मिक्सिंग क्वेंच-फ्लो इंस्ट्रूमेंट और 1 एमएस के अस्थायी रिज़ॉल्यूशन का उपयोग15 किया जाता है। जबकि मिलीसेकंड एचडीएक्स-एमएस हाल ही में एएसवाईएन के अध्ययन में तीव्रता से महत्वपूर्ण रहा है, यह आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन / क्षेत्रों का अधिक व्यापक रूप से अध्ययन करने में मूल्यवान है और छोरों / क्षेत्रों के साथ बड़ी संख्या में प्रोटीन जो केवल कमजोर रूप से स्थिर हैं। उदाहरण के लिए, पेप्टाइड दवाएं (जैसे, इंसुलिन; जीएलपी -1 / ग्लूकागन; टिर्जेपेटाइड) और पेप्टाइड-फ्यूजन प्रोटीन (जैसे, एचआईवी अवरोधक एफएन 3-एल 35-टी 1144) प्रमुख दवा प्रारूप हैं जहां समाधान-चरण संरचनात्मक और स्थिरता की जानकारी दवा विकास निर्णयों के लिए एक महत्वपूर्ण इनपुट हो सकती है, और फिर भी, पेप्टाइड मॉइटी अक्सर एचडीएक्स-एमएस द्वारा सेकंड टाइमस्केल16,17,18,19,20 पर केवल कमजोर रूप से स्थिर और असभ्य होता है . मिनट डोमेन में लेबलिंग के साथ आकस्मिक एचडीएक्स-एमएस विधियों को डीएनए जी-क्वाड्रप्लेक्स के लिए संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन मिलीसेकंड एचडीएक्स-एमएस21 के आवेदन द्वारा इसे अधिक विविध ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संरचनाओं तक विस्तारित करना संभव होना चाहिए।

एचडीएक्स-एमएस प्रयोगों को तीन अलग-अलग स्तरों पर किया जा सकता है: (1) बॉटम-अप (जिससे लेबल प्रोटीन प्रोटियोलिटिक रूप से पच जाता है), (2) मिडिल-डाउन (जिससे लेबल प्रोटीन प्रोटियोलिटिक रूप से पच जाता है, और परिणामस्वरूप पेप्टाइड्स को नरम-विखंडन तकनीकों द्वारा आगे खंडित किया जाता है), और (3) टॉप-डाउन (जिससे नरम-विखंडन तकनीक सीधे लेबल प्रोटीन को खंडित करती है)22 . इस प्रकार, उप-आणविक एचडीएक्स-एमएस डेटा हमें प्रोटीन के विशिष्ट क्षेत्रों में विनिमय व्यवहार को स्थानीयकृत करने की अनुमति देता है, जिससे ऐसे प्रयोगों के लिए पर्याप्त अनुक्रम कवरेज होना महत्वपूर्ण हो जाता है। किसी भी एचडीएक्स-एमएस प्रयोग का संरचनात्मक संकल्प क्रमशः पाचन या नरम-विखंडन पर प्रोटीन से प्राप्त प्रोटियोलिटिक पेप्टाइड्स या टुकड़ों की संख्या पर निर्भर करता है। ऊपर उल्लिखित तीन प्रयोग प्रकारों में से प्रत्येक में, प्रत्येक पेप्टाइड /टुकड़े पर एमाइड एक्सचेंज में परिवर्तन प्रोटीन के स्थानीयकृत क्षेत्रों के व्यवहार को इंगित करने के लिए प्रोटीन की प्राथमिक संरचना पर वापस मैप किया जाता है। जबकि उच्चतम संरचनात्मक संकल्प नरम-विखंडन के माध्यम से प्राप्त किया जाता है, इन प्रयोगों का विवरण वर्तमान अध्ययन के दायरे से बाहर है, जो एएसवाईएन मोनोमर रचनाओं के माप पर केंद्रित है। यहां वर्णित आमतौर पर लागू "बॉटम-अप" वर्कफ़्लो के साथ उत्कृष्ट परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं।

यहां, प्रक्रियाएं (1) एएसआईएन नमूनों और एचडीएक्स-एमएस बफर को कैसे तैयार और संभालें, (2) बॉटम-अप एचडीएक्स-एमएस प्रयोग के लिए पेप्टाइड मैपिंग कैसे करें, (3) शारीरिक स्थितियों के तहत मोनोमेरिक एएसवाईएन पर एचडीएक्स-एमएस डेटा कैसे प्राप्त करें, विशेष रूप से मिलीसेकंड टाइम डोमेन में (कस्टम-निर्मित उपकरण का उपयोग करके; मिलीसेकंड लेबलिंग के लिए वैकल्पिक उपकरण भी वर्णित किए गए हैं), और (4) एचडीएक्स-एमएस डेटा को कैसे संसाधित और विश्लेषण करें। दो समाधान स्थितियों में शारीरिक पीएच (7.40) पर मोनोमेरिक एसिन का उपयोग करने के तरीके यहां उदाहरण दिए गए हैं। जबकि एएसवाईएन के अध्ययन में गंभीर रूप से उपयोगी है, इन प्रक्रियाओं को किसी भी प्रोटीन पर लागू किया जा सकता है और आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन तक सीमित नहीं है।

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Protocol

1. प्रोटीन अभिव्यक्ति और एसिन की शुद्धि

  1. पहले प्रकाशित रिपोर्ट9 के बाद एएसवाईएन तैयार करें।
  2. एक सुरक्षित भंडारण बफर (जैसे, ट्रिस, पीएच 7.2) में डायलिज़ करें।
  3. यदि आवश्यक हो, तो नमूना केंद्रित करें (उदाहरण के लिए, 3 केडीए एमडब्ल्यूसीओ का उपयोग करके स्पिन फ़िल्टर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब, लगभग 10-30 मिनट के लिए 14,000 एक्स जी , सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: अत्यधिक ध्यान केंद्रित न करने की सलाह दी जाती है। मोनोमर पहनावा की अखंडता को 25 μM से परे सत्यापित नहीं किया गया है।
  4. विभाज्य और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
    नोट: इन भंडारण स्थितियों में एएसवाईएन मोनोमर प्रोटीन 1 वर्ष तक स्थिर है।

2. एचडीएक्स बफर तैयारी

नोट: चूंकि ट्रिस में एक उच्च तापमान गुणांक है, इसलिए पीएच माप को उस तापमान के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है जिस पर एचडीएक्स प्रतिक्रिया की जाएगी, जो इस प्रोटोकॉल में 20 डिग्री सेल्सियस है।

  1. एलसी-एमएस ग्रेड पानी के 100 एमएल में ट्रिस के 0.002 मोल वजन करके राज्य ए और राज्य बी के लिए संतुलन बफर तैयार करें। राज्य बी के लिए, ट्रिस बफर में 29.8 मिलीग्राम केसीएल, 14.2 मिलीग्राम एमजीसीएल2, 36.8 ग्राम सीएसीएल2 और 836 मिलीग्राम एनएसीएल जोड़ें। पीएच को 7.40 ± 0.05 में समायोजित करें।
    नोट: संतुलन बफर में वे स्थितियां होनी चाहिए जिन पर एएसवाईएन का अध्ययन किया जाना है। इस मामले में, यह पीएच 7.4 +/− लवण पर 20 एमएम ट्रिस है।
  2. ट्रिस के 0.002 मोल को 100 मिलीलीटर ड्यूटेरेटेड पानी में तौलकर राज्य ए और राज्य बी के लिए लेबलिंग बफर तैयार करें। राज्य बी के लिए, ट्रिस लेबलिंग बफर में 29.8 मिलीग्राम केसीएल, 14.2 मिलीग्राम एमजीसीएल2, 36.8 ग्राम सीएसीएल2 और 836 मिलीग्राम एनएसीएल जोड़ें। लेबलिंग बफर का पीडी संतुलन बफर के पीएच से मेल खाता है। चूंकि पीएच = पीडी - 0.41, समायोजित करें ताकि पीएच मीटर 6.99 ± 0.0523,24 पढ़ता है।
    नोट: लेबलिंग बफर को संतुलन बफर के समान घटकों की आवश्यकता होती है, सिवाय इसके कि यह ड्यूटेरेटेड पानी का उपयोग करके तैयार किया जाता है।
  3. ट्रिस के 0.010 मोल और यूरिया के 0.050 मोल का वजन करके शमन बफर तैयार करें और एलसी-एमएस ग्रेड पानी के साथ 100 एमएल तक बनाएं। पीएच को 0.5 डिग्री सेल्सियस पर 2.50 ± 0.05 में समायोजित करें।
    नोट: ब्याज के प्रोटीन के लिए सबसे अच्छा बुझाने बफर की पहचान करने के लिए एचडीएक्स प्रयोगों से पहले एक बुझाने बफर स्क्रीन किया जाना चाहिए। विकृतीकरण (जैसे, यूरिया और गुआनिडिनियम हाइड्रोक्लोराइड) और कम करने वाले एजेंटों (जैसे, ट्रिस (2-कार्बोक्सीथाइल) फॉस्फीन) के विभिन्न सांद्रता और संयोजनों की जांच की जाती है, साथ ही भौतिक मापदंडों जैसे कि फँसाने की मात्रा और तापमान, बुझाने वाले प्रोटीन को प्रभावी ढंग से प्रकट करने और पचाने के लिए। पीएच 2.50 पर 100 एमएम ट्रिस और 0.5 एम यूरिया युक्त एक शमन बफर वर्तमान अध्ययन के लिए इष्टतम है।
  4. एक डुरान कांच की बोतल में गुआनिडिनियम हाइड्रोक्लोराइड के 0.125 मोल वजन करके पाचन स्तंभ धोने बफर तैयार करें। मेथनॉल के 25 मिलीलीटर और फार्मिक एसिड के 250 μL जोड़ें। एलसी-एमएस ग्रेड पानी के साथ 250 एमएल तक बनाएं।
    नोट: एंजाइमेट बीईएच पेप्सिन कॉलम के लिए ( सामग्री की तालिका देखें), 0.5 एम गुआनिडिनियम हाइड्रोक्लोराइड, 10% (वी / वी) मेथनॉल, और 0.1% (वी / वी) फॉर्मिक एसिड के कॉलम वॉश बफर का उपयोग करें।
  5. एलसी-एमएस ग्रेड पानी के 249.5 एमएल में फॉर्मिक एसिड के 0.5 μL पाइपिंग द्वारा सिरिंज कमजोर धोने तैयार करें।
  6. एलसी-एमएस ग्रेड पानी, मेथनॉल, एसिटोनाइट्राइल और आइसोप्रोपेनॉल के बराबर भागों को मिलाकर सिरिंज मजबूत धोने तैयार करें। अंतिम 2% (वी / वी) एकाग्रता में फॉर्मिक एसिड जोड़ें।
    नोट: विभिन्न बफ़र्स और प्रोटीन के बीच क्रॉस-संदूषण को रोकने और इंजेक्शन पोर्ट की सफाई को सक्षम करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि सिरिंज धोने के समाधान तैयार किए जाते हैं और वाल्व के प्रवाह पथ (अक्सर "वॉश लाइनर" नाम दिया जाता है) पूरी तरह से तरल के साथ प्राइम किया जाता है। फॉर्मिक एसिड सिरिंज कमजोर धोने के लिए वैकल्पिक है।

3. पेप्टाइड मानचित्रण प्रक्रिया

  1. नीचे दिए गए चरण के बाद नमूना तैयार करें।
    1. 0.22 μm सिरिंज फिल्टर के साथ -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से फ़िल्टर पिघला हुआ एएसवाईएन प्रोटीन स्टॉक। बीयर-लैम्बर्ट कानून द्वारा एकाग्रता निर्धारित करने के लिए 280 एनएम पर फ़िल्टर किए गए स्टॉक प्रोटीन के अवशोषण को मापें। संतुलन बफर (चरण 2.1.) में 5 μM की एकाग्रता के लिए प्रोटीन पतला।
      नोट: बीयर-लैम्बर्ट कानून: ए = εसीएल, जहां ए अवशोषण है, ε मापा तरंग दैर्ध्य (यहां 280 एनएम) पर प्रोटीन का विलुप्त होने गुणांक है, जिसमें इकाइयां एम−1सेमी−1 हैं, सी एम में प्रोटीन एकाग्रता है, और एल सेमी में पथ लंबाई है। जंगली प्रकार के एएसवाईएन26 के लिए, ε = 5960 एम−1सेमी−1।
  2. तरल क्रोमैटोग्राफी विधि स्थापित करें।
    1. 7000-9000 पीएसआई के दबाव में 3 मिनट के लोडिंग /ट्रैपिंग समय के साथ एक इनलेट फ़ाइल बनाएं, इसके बाद 7 मिनट में 5% एसिटोनाइट्राइल से 40% एसिटोनिट्राइल की ढाल, इसके बाद 10 मिनट के लिए 5% -95% एसिटोनिट्राइल-पानी के बार-बार धोने के चरण।
    2. सुनिश्चित करें कि लॉक स्प्रे (उदाहरण के लिए, ल्यूसीन एन्केफेलिन, सामग्री की तालिका देखें) 2000 पीएसआई पर बह रहा है और मास स्पेक्ट्रोमीटर के स्रोत लॉक स्प्रे जांच से जुड़ा हुआ है।
  3. मास स्पेक्ट्रोमेट्री एमएसई विधियों को सेट करें।
    नोट: एमएसई कोई अग्रदूत बड़े पैमाने पर अलगाव के साथ एक ब्रॉडबैंड डेटा-स्वतंत्र अधिग्रहण विधि है। इसलिए, चयनित एम/जेड रेंज के भीतर सभी आयनों को टकराव-प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) 27 का उपयोग करके आगे खंडित किया जाता है।
    1. एमएस विधि फ़ाइल में, एमएसई निरंतरता चुनें और 2-10 मिनट, इलेक्ट्रोस्प्रे स्रोत और सकारात्मक रिज़ॉल्यूशन मोड के बीच अधिग्रहण समय सेट करें। 50-2000 दा से अधिक एमएसई प्राप्त करें, हर 0.3 एस स्कैनिंग करें।
    2. फ़ंक्शन 1 (कम ऊर्जा) के लिए, जाल सेट करें और टकराव ऊर्जा को 4 वी होने के लिए स्थानांतरित करें। फ़ंक्शन 2 (उच्च ऊर्जा) के लिए, रैंप ट्रांसफर टकराव ऊर्जा को 4 वी पर स्थिर होने के लिए सेट करें और प्रत्येक मैपिंग ऊर्जा स्तर के लिए तालिका 1 में बताए गए जाल टकराव ऊर्जा को सेट करें।
      नोट: आयन-गतिशीलता एमएसई विधियों का भी उपयोग किया जा सकता है। वैकल्पिक मानचित्रण विधियों (जैसे, डेटा-निर्भर अधिग्रहण या डीडीए) का उपयोग उपयोगकर्ता विवेक पर किया जा सकता है।
  4. ऑटोसैंपलर रोबोट सेट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. कुल वसूली शीशी के लिए 5 μM प्रोटीन के 50 μL जोड़ें। एचडीएक्स सही कक्ष में एक नमूना स्थिति में शीशी रखें। सुनिश्चित करें कि यह कक्ष 0.5 डिग्री सेल्सियस पर है।
    2. एचडीएक्स बाएं कक्ष में अभिकर्मक पदों एक, दो और तीन के लिए संतुलन बफर की एक अभिकर्मक शीशी और लेबलिंग बफर की दो अभिकर्मक शीशियों को जोड़ें। सुनिश्चित करें कि यह कक्ष पेल्टियर तापमान नियंत्रक सेट करके 20 डिग्री सेल्सियस पर है ( सामग्री की तालिका देखें)। एचडीएक्स सही कक्ष में अभिकर्मक स्थिति में बुझाने बफर की एक अभिकर्मक शीशी जोड़ें।
    3. एचडीएक्स बाएं कक्ष की प्रतिक्रिया स्थितियों में आठ कुल वसूली शीशियों और एचडीएक्स दाएं कक्ष की प्रतिक्रिया स्थितियों में आठ अधिकतम वसूली शीशियों को जोड़ें।
      नोट: वितरित मात्रा की पूर्ण सफाई और अधिकतम प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए, ऑटोसैंपलर सिरिंज पर सिरिंज धोने और प्राइम वॉश करने की सलाह दी जाती है। उदाहरण के लिए, मैपिंग प्रयोगों को शुरू करने से पहले (1) कमजोर धोने, (2) मजबूत धोने, (3) कमजोर धोने का अनुक्रम निष्पादित करें। इस अनुक्रम को बड़े पैमाने पर दोहराया जा सकता है, और इसे 20x तक या सिरिंज पूरी तरह से गीला होने तक करने की सिफारिश की जाती है।
    4. शेड्यूलिंग सॉफ़्टवेयर में उपयुक्त एलसी और एमएस विधियों के साथ एक नमूना सूची सेट करें और शेड्यूल शुरू करें।
      नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, क्रोनोस का उपयोग शेड्यूलिंग सॉफ़्टवेयर के रूप में किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
  5. मैपिंग डेटा संसाधित करें।
    1. उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके मैपिंग प्रयोग फ़ाइलों से पेप्टाइड्स की पहचान करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. निम्नलिखित पेप्टाइड थ्रेशोल्ड मापदंडों का उपयोग करके डायनामएक्स ( सामग्री की तालिका देखें) में पेप्टाइड पहचान डेटा आयात करें: न्यूनतम तीव्रता = 5000, न्यूनतम अनुक्रम लंबाई = 0, अधिकतम अनुक्रम लंबाई = 40, न्यूनतम उत्पाद = 1, अमीनो एसिड प्रति न्यूनतम उत्पाद = 0.25, न्यूनतम लगातार उत्पाद = 2, उत्पादों के लिए न्यूनतम योग तीव्रता = 0, न्यूनतम स्कोर = 0, और अधिकतम एमएच + त्रुटि (पीपीएम) = 0।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, अनुशंसित वर्कफ़्लो28 के अनुसार अनुकूलित सेटिंग्स प्राप्त करें।
    3. मेनू से डेटा का चयन करें और आयात पीएलजीएस परिणाम पर क्लिक करें। वर्णक्रमीय असाइनमेंट के लिए प्रासंगिक डेटा फ़ाइलों को चुनने के लिए जोड़ें पर क्लिक करें। जब सभी को जोड़ दिया जाता है, तो अगला पर क्लिक करें और उपरोक्त फ़िल्टर सेटिंग्स दर्ज करें। फिर , समाप्त पर क्लिक करें।
    4. डायनामएक्स में एएसवाईएन के अंतिम पेप्टाइड कवरेज मानचित्र को प्राप्त करने के लिए मैन्युअल रूप से आइसोटोपिक असाइनमेंट क्यूरेट करें।

4. मिलीसेकंड हाइड्रोजन / ड्यूटेरियम विनिमय अध्ययन

  1. एचडीएक्स प्रयोगों को शुरू करने से पहले फास्टएचडीएक्स प्रोटोटाइप इंस्ट्रूमेंट ( सामग्री की तालिका देखें) को साफ करें।
    1. संगत एचडीएक्स सॉफ़्टवेयर जीयूआई खोलें और सिस्टम को प्रारंभ करने की अनुमति दें।
    2. 20 डिग्री सेल्सियस के रूप में नमूना चैंबर तापमान और 0.5 डिग्री सेल्सियस के रूप में शमन चैंबर दर्ज करें। नए तापमान को लागू करने के लिए सेट पर क्लिक करें।
    3. सभी इनलेट्स पर एलसी-एमएस ग्रेड पानी के साथ अपकेंद्रित्र ट्यूब स्थापित करें।
    4. टिट्रेटर नलसाजी वितरण टैब में, बाएं और दाएं दोनों सिरिंज की जांच करें और ट्यूबों में किसी भी अव्यक्त हवा के बुलबुले को हटाने के लिए प्राइम पर क्लिक करें। सभी बुलबुले चले जाने तक दोहराएं।
    5. मैक्रोज़ टैब में, सिरिंज के लिए सभी बक्सों की जाँच करें। कैलिब्रेट सिरिंज होम पोजीशन पर क्लिक करें। वॉश सिरिंज लोड लूप पर क्लिक करें। वॉश ऑल मिक्सिंग लूप वॉल्यूम पर क्लिक करें।
    6. चरण 4.1.5 दोहराएँ। 1x अधिक।
    7. यदि कोई बुलबुले बफर सिरिंज में दिखाई देते हैं, तो सिरिंज को डिस्कनेक्ट करके और बुलबुले को लंबवत रूप से बाहर निकालकर डीगैस करें। सिरिंज को बदलें और शून्य स्थिति में पुन: कैलिब्रेट करें।
  2. एचडीएक्स प्रयोगों के लिए फास्टएचडीएक्स प्रोटोटाइप उपकरण स्थापित करें।
    1. कुल वसूली शीशी में फ़िल्टर किए गए 5 μM aSyn के 500 uL जोड़ें और तापमान प्रेरित ऑलिगोमेराइजेशन और एकत्रीकरण को रोकने के लिए एक टेबलटॉप फ्रिज के अंदर रखें।
    2. प्रत्येक बफर (2) में संतुलन, लेबलिंग और बुझाने के बफर के 50 एमएल जोड़ें। एचडीएक्स बफर तैयारी चरण 1-3) बाएं और दाएं कक्षों में इनलेट।
    3. कॉलम वॉश बफर के 50 एमएल जोड़ें (2). एचडीएक्स बफर तैयारी चरण 4) पेप्सिन धोने इनलेट के लिए।
    4. प्रोटीन और कॉलम वॉश लाइनों को प्राइम करने के लिए 1x, टिट्रेटर प्लंबिंग डिलीवरी टैब में बाएं और दाएं दोनों सिरिंज की जांच करें और एक बार प्राइम पर क्लिक करें।
      नोट: प्राइम पर कोई भी बाद का क्लिक प्राइम प्रक्रिया के अतिरिक्त दोहराव का कारण होगा, जिसके परिणामस्वरूप बड़ी मात्रा में प्रोटीन नमूने की खपत होगी। इससे बचने की सलाह दी जाती है, भले ही बटन क्लिक करने के बाद सॉफ्टवेयर में देरी हो।
    5. चरण 4.1.5 दोहराएँ। 1x.
    6. मैन्युअल क्वेंच फ्लो टैब में, चरण 4.2.7.-4.2.10 में समझाया गया आवश्यक सेटिंग्स दर्ज करें।
    7. एक समय-पाठ्यक्रम प्रयोग के लिए, प्रतीकात्मक डॉट्स बटन का उपयोग करके मिलीसेकंड में समय दर्ज करें। यदि प्रतिकृतियों की आवश्यकता होती है, तो एक ही टाइमपॉइंट को कई बार जोड़ें, उदाहरण के लिए, 50 एमएस के ट्रिप्लिकेट के लिए, 50 50 50 दर्ज करने की आवश्यकता है। मास स्पेक्ट्रोमीटर सॉफ़्टवेयर में नमूना सूची (मासलिंक्स का उपयोग यहां किया जाता है, सामग्री की तालिका देखें) को उन टाइमपॉइंट्स से बिल्कुल मेल खाने की आवश्यकता है।
      नोट: मास स्पेक्ट्रोमीटर नमूना सूची फ़ाइल नाम और /या नमूना पाठ का उपयोग फास्टएचडीएक्स सॉफ़्टवेयर जीयूआई में दर्ज किए गए लोगों के अनुरूप एचडीएक्स लेबलिंग समय का स्थायी रिकॉर्ड सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए। प्रत्येक नमूना चलाने के लिए लेबलिंग समय कहीं और संग्रहीत नहीं किया जाएगा।
    8. ट्रैप टाइम (मिनट) को ट्रैपिंग समय की लंबाई होने के लिए सेट करें। यहाँ, यह 3.00 है।
    9. एचपीएलसी (मिनट) = (ट्रैप समय + रन टाइम + 1.5 मिनट) के लिए प्रतीक्षा करें।
      नोट: उदाहरण के लिए, 3 मिनट फँसाने और 17 मिनट ढाल के साथ एक प्रयोग के लिए, यह 21.50 मिनट होगा।
    10. नमूना रन के बीच रिक्त प्रयोग चलाते समय केवल रिक्त चलाएँ बॉक्स पर क्लिक करें। यदि हां, तो प्रत्येक नमूना चलाने के बाद रिक्त रन के लिए सॉफ़्टवेयर में एक प्रविष्टि (यानी, नमूना सूची पर एक मान्य पंक्ति) सुनिश्चित करें।
    11. एक बार सॉफ्टवेयर पर नमूना सूची तैयार हो जाने के बाद, उपयुक्त प्रविष्टियों को हाइलाइट करें और सॉफ़्टवेयर में प्ले बटन और फास्टएचडीएक्स पर क्लिक करके सॉफ़्टवेयर में रन शुरू करें।
      ड्यूटेरियम स्क्रैम्बलिंग के कारण, एमएस-केवल विधियों या नरम-विखंडन तकनीकों (इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण पृथक्करण, इलेक्ट्रॉन कैप्चर पृथक्करण, और पराबैंगनी फोटो-पृथक्करण) का उपयोग केवल29 किया जा सकता है। 7.40 के शारीरिक पीएच पर एएसवाईएन के लिए, 50 एमएस से 300 एस तक के टाइमपॉइंट सबसे अधिक लागू होते हैं क्योंकि ये पूरे ड्यूटेरियम अपटेक वक्र8 को कवर करते हैं।

5. डाटा प्रोसेसिंग

  1. पेप्टाइड मैपिंग प्रयोगों से स्पेक्ट्रम असाइन किए गए पेप्टाइड्स की फ़ाइल लोड करें। फ़ाइल मेनू खोलें और डायनामएक्स सॉफ़्टवेयर में खोलें पर क्लिक करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. पसंदीदा द्रव्यमान माप सॉफ्टवेयर (जैसे, डायनामएक्स, एचडीएक्जामिनर, आदि) में कच्ची फ़ाइलों को आयात करें। "डेटा" मेनू खोलें और एमएस फ़ाइलों पर क्लिक करें। अध्ययन किए गए प्रत्येक प्रोटीन स्थिति के लिए राज्य बनाने के लिए नए राज्य पर क्लिक करें।
    1. प्रत्येक एचडीएक्स टाइमपॉइंट जोड़ने के लिए न्यू एक्सपोजर पर क्लिक करें। .raw फ़ाइलों को आयात करने के लिए न्यू रॉ पर क्लिक करें। प्रत्येक .raw फ़ाइल को सही स्थिति में खींचें। पूरा होने पर ओके पर क्लिक करें।
  3. पहले आइसोटोप स्वचालित रूप से असाइन करें (यह ऊपर दिए गए चरण 5.2 के बाद स्वचालित है), फिर उच्च डेटा गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए आइसोटोपिक असाइनमेंट को मैन्युअल रूप से क्यूरेट करें।
  4. क्लस्टर डेटा को निम्न क्रम में कॉलम के साथ एक .csv फ़ाइल में निर्यात करें: प्रोटीन नाम, अनुक्रम प्रारंभ संख्या, अनुक्रम अंत संख्या, अनुक्रम, संशोधन, टुकड़ा, अधिकतम संभव तेज, मोनोआइसोटोपिक प्रजातियों का द्रव्यमान, राज्य का नाम, एक्सपोज़र समय, फ़ाइल नाम, चार्ज, प्रतिधारण समय, तीव्रता, और केंद्रक।
  5. बड़े पैमाने पर माप सॉफ़्टवेयर में डेटा मेनू खोलें और निर्यात क्लस्टर डेटा पर क्लिक करें।

6. डेटा विश्लेषण

  1. निर्यात किए गए क्लस्टर डेटा को पसंदीदा HDX विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में लोड करें। यहां, एचडीफ्लेक्स का उपयोग30 किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. सभी पेप्टाइड्स और राज्यों के लिए प्रयोगात्मक डेटा फिट करें, एचडीएक्स प्रतिक्रिया के लिए मनाया दर स्थिरांक प्राप्त करने के लिए उपयुक्त बैक-एक्सचेंज सुधार विधियों का चयन करें।
  3. पसंदीदा विधि द्वारा एक वैश्विक महत्व सीमा की गणना करें (एचडीफ्लेक्स इसके लिए कई विकल्पों का समर्थन करता है) और31,32 की तुलना में राज्यों में महत्वपूर्ण अंतर निर्धारित करने के लिए हाइब्रिड महत्व परीक्षण करें।
    नोट: यदि मनाया गया अंतर वैश्विक सीमा से अधिक है और पी-मान चुने हुए आत्मविश्वास स्तर (जैसे, 95%) से कम है, तो अंतर को महत्वपूर्ण माना जाता है।

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Representative Results

इसकी आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रकृति के कारण, शारीरिक पीएच पर एएसवाईएन में जटिल संरचनात्मक परिवर्तनों को पकड़ना मुश्किल है। एचडीएक्स-एमएस रीढ़ की हड्डी एमाइड हाइड्रोजन पर आइसोटोपिक एक्सचेंज पर नज़र रखता है, प्रोटीन विरूपण गतिशीलता और इंटरैक्शन की जांच करता है। यह उच्च संरचनात्मक और लौकिक संकल्पों पर इस जानकारी को प्राप्त करने के लिए कुछ तकनीकों में से एक है। यह प्रोटोकॉल मोटे तौर पर प्रोटीन और बफर स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होता है, और यह दो अलग-अलग समाधान स्थितियों में एएसवाईएन के विनिमय कैनेटीक्स के माप द्वारा अनुकरणीय है: राज्य ए और राज्य बी8, जैसा कि चरण 2.1.-2.2 में परिभाषित किया गया है।

सबसे पहले, एएसवाईएन पर एक मानचित्रण प्रयोग किया गया था, और एक पेप्टाइड कवरेज मानचित्र प्राप्त किया गया था, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है। मानचित्र में प्रोटीन अनुक्रम का 100% शामिल है और इसमें 3.79 की औसत अतिरेक है। 100% कवरेज मूल्य इंगित करता है कि प्रोटीन में सभी अमीनो एसिड प्रोटीन डाइजेस्ट में पाए गए थे और एएसवाईएन के विनिमय व्यवहार के व्यापक विश्लेषण को सक्षम करेंगे। अतिरेक मान अतिव्यापी पेप्टाइड्स की संख्या को इंगित करता है। एक उच्च अतिरेक मूल्य अंतिम मानचित्र के संरचनात्मक रिज़ॉल्यूशन को बढ़ाता है, जो पेप्टाइड्स32 को ओवरलैप करने के लिए डेटा के घटाव चपटा को देखता है।

तेजी से मिश्रण बुझाने-प्रवाह साधन प्रोटोटाइप का उपयोग करना ( सामग्री की तालिका देखें), राज्य ए और राज्य बी में पीएच 7.4 पर एएसवाईएन पर उच्च गुणवत्ता, मिलीसेकंड-टाइमस्केल एचडीएक्स-एमएस डेटा एकत्र किया गया था (चित्रा 2)। डायनामएक्स में एक आइसोटोपिक असाइनमेंट के बाद, "क्रूड" ड्यूटेरियम अपटेक घटता प्राप्त किया गया था, जैसा कि चित्रा 3 ए में दिखाया गया है। यह प्रत्येक प्रोटीन डोमेन में चयनित तीन पेप्टाइड्स के लिए अपटेक कर्व्स दिखाता है। समय के साथ ड्यूटेरियम निगमन प्रदर्शित किया जाता है। एक्स-अक्ष मिलीसेकंड टाइमस्केल पर है, जो शारीरिक स्थितियों में एएसवाईएन के बहुत तेज़ कैनेटीक्स के साथ संरेखित करता है। लाल छायांकित क्षेत्र आमतौर पर पारंपरिक एचडीएक्स उपकरणों से प्राप्त डेटा को दिखाता है, जिसमें 30 एस से माप शुरू होता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि तथाकथित "समय-खिड़की विस्तार" के लिए पीएच हेरफेर द्वारा इसे और कम नहीं किया जा सकता है; यह दृष्टिकोण आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन / क्षेत्रों के अध्ययन के लिए अमान्य है, क्योंकि पीएच शिफ्ट कमजोर स्थिर पॉलीपेप्टाइड के विरूपण पहनावा को परेशान करेगा। जैसा कि यहां देखा जा सकता है, अधिकांश एसिन पूरी तरह से 1 एस (चित्रा 3 सी) द्वारा आदान-प्रदान किया जाता है। यह मोनोमेरिक एसिन के लिए मिलीसेकंड एचडीएक्स माप के महत्व को दर्शाता है क्योंकि विनिमय प्रतिक्रिया के लिए पूर्ण गतिज तेज वक्र पर कब्जा कर लिया जाता है, जो मोनोमर रचनाओं का सबसे सटीक माप पैदा करता है।

एचडीफ्लेक्स ने पठार ड्यूटेरियम निगमन का उपयोग करके बैक-एक्सचेंज सुधार किया। डेटा बिंदुओं को बाद में समीकरण 1 के अनुसार फिट किया गया था, जो एक मनाया दर स्थिर, केओबीएस, विलायक पहुंच और उस विशेष पेप्टाइड (चित्रा 3 बी) की हाइड्रोजन बॉन्डिंग भागीदारी का संकेत प्रदान करता है।

Equation 1समीकरण 1

जहां डीटी समय पर ड्यूटेरियम निगमन है टी, एनएक्सपी घातीय चरणों की संख्या है, एन लेबिल हाइड्रोजन की अधिकतम संख्या है, केओबीएस मनाया विनिमय दर स्थिर है, और β एक स्ट्रेचिंग कारक 30,33 है।

वक्र फिटिंग के बाद, फिट वक्र के तहत तेज क्षेत्र की गणना प्रयोगात्मक समय खिड़की के भीतर तेज वक्र का वर्णन करने वाले फिट फ़ंक्शन को एकीकृत करके की जा सकती है। दोनों राज्यों के उत्थान क्षेत्र के बीच सांख्यिकीय महत्व विश्लेषण किया गया था। सबसे पहले, अपटेक क्षेत्र के लिए एक वैश्विक महत्व सीमा की गणना एचडीफ्लेक्स में 95% के आत्मविश्वास स्तर पर की गई थी। अपटेक क्षेत्र अंतर भूखंडों को तब उत्पन्न किया गया था, संरचनात्मक संकल्प के दो स्तरों पर राज्य ए और राज्य बी के बीच अंतर दिखा रहा था: पेप्टाइड रिज़ॉल्यूशन (चित्रा 4 ए) और एमिनो एसिड रिज़ॉल्यूशन (चित्रा 4 बी)। पेप्टाइड रिज़ॉल्यूशन अंतर साजिश प्रत्येक व्यक्तिगत पेप्टाइड के लिए राज्य ए और राज्य बी के बीच तेज क्षेत्र में अंतर दिखाती है, जबकि अमीनो एसिड रिज़ॉल्यूशन अंतर साजिश एसआईएन30,34 के पूरे एमिनो एसिड अनुक्रम में राज्य ए और राज्य बी के बीच तेज क्षेत्र में अंतर दिखाती है। दोनों भूखंड राज्य ए की तुलना में राज्य बी में एएसवाईएन मोनोमर में समग्र रूप से अधिक ड्यूटेरियम अपटेक का संकेत देते हैं। इस खोज को चित्रा 3 में ड्यूटेरियम अपटेक भूखंडों की जांच करके उचित ठहराया जा सकता है, जहां राज्य बी अपटेक वक्र हमेशा राज्य ए अपटेक वक्र से ऊपर होता है। इसके अलावा, यह देखा जा सकता है कि सी-टर्मिनस पर अपटेक क्षेत्र अंतर का परिमाण बहुत अधिक है। एक बार फिर, इसे मूल अपटेक घटता पर वापस ट्रेस करके उचित ठहराया जा सकता है, जहां सी-टर्मिनल पेप्टाइड्स (पेप्टाइड्स 124-140 चित्रा 3 में दिखाए गए हैं) प्रोटीन के बाकी हिस्सों की तुलना में तेज घटता के बीच बहुत बड़ा अंतर दिखाते हैं। अंत में, राज्य बी में समाधान की स्थिति विलायक जोखिम में वृद्धि या पूरे प्रोटीन में हाइड्रोजन-बॉन्डिंग नेटवर्क भागीदारी में कमी का कारण बनती है लेकिन सी-टर्मिनस पर अधिक होती है।

Figure 1
चित्रा 1: कुल 30 पेप्टाइड्स और 100% अनुक्रम कवरेज के साथ जंगली प्रकार के एएसवाईएन का पेप्टाइड कवरेज मानचित्र। एएसवाईएन के तीन डोमेन को निम्नानुसार हाइलाइट किया गया है: एन-टर्मिनस (नीला), गैर-अमाइलॉइड बीटा घटक क्षेत्र (पीला), और सी-टर्मिनस (लाल)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: aSyn पर मिलीसेकंड HDX-MS प्रयोग के लिए वर्कफ़्लो। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: राज्य ए (पीला) और राज्य बी (नीला) के लिए एएसवाईएन के तीन डोमेन में चुने गए तीन पेप्टाइड्स से उदाहरण अपटेक प्लॉट। (ए) अनफिट और गैर-बैक-एक्सचेंज सही अपटेक प्लॉट। (बी) फिट और बैक-एक्सचेंज सही अपटेक प्लॉट। लाल छायांकित क्षेत्र पारंपरिक एचडीएक्स-एमएस सिस्टम द्वारा प्राप्य डेटा का प्रतिनिधित्व करता है, आमतौर पर 30 एस से शुरू होता है। त्रुटि पट्टियाँ तीन प्रतिकृतियों के मानक विचलन के अनुरूप होती हैं। (सी) प्रति टाइमपॉइंट अमीनो एसिड अनुक्रम में प्रतिशत ड्यूटेरियम अपटेक का हीटमैप प्लॉट। रंग पट्टी ड्यूटेरियम अपटेक के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
(ए) पेप्टाइड अवशेष रिज़ॉल्यूशन प्लॉट राज्य ए और राज्य बी के बीच प्रत्येक पेप्टाइड के अपटेक क्षेत्र अंतर को दिखाते हैं (बी) एमिनो एसिड रिज़ॉल्यूशन प्लॉट राज्य ए और राज्य बी के बीच अपटेक क्षेत्र अंतर दिखाते हैं जो अमीनो एसिड अनुक्रम में राज्य ए और राज्य बी के बीच तेज क्षेत्र अंतर दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ऊर्जा स्तर का मानचित्रण रैंप वोल्टेज (वी)
नीचा 20-40
मध्यम 25-45
उच्च 30-50
बहुत ऊंचा 35-55

तालिका 1: ऊर्जा के स्तर और इसी हस्तांतरण रैंप वोल्टेज मानचित्रण।

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Discussion

वर्तमान लेख में, निम्नलिखित प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है: (1) उच्चतम अनुक्रम कवरेज प्राप्त करने के लिए मोनोमेरिक एएसवाईएन पर पेप्टाइड मैपिंग प्रयोग करना, (2) शारीरिक स्थितियों के तहत मोनोमेरिक एएसवाईएन पर मिलीसेकंड एचडीएक्स-एमएस डेटा प्राप्त करना, और (3) परिणामी एचडीएक्स-एमएस डेटा का डेटा विश्लेषण और व्याख्या करना। प्रदान की गई प्रक्रियाएं आम तौर पर निष्पादित करने के लिए सरल होती हैं, प्रत्येक लेबलिंग प्रयोग आमतौर पर तीन प्रतिकृतियों और आठ टाइमपॉइंट्स के लिए केवल 8 घंटे तक रहता है, और मैपिंग प्रयोग केवल 2 घंटे के आसपास रहता है। यहां उपयोग किए जाने वाले पूरी तरह से स्वचालित इंस्ट्रूमेंटेशन को देखते हुए, 1 दिन में एक पूर्ण डेटासेट प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, नमूनों को संभालते समय और बफर तैयार करते समय, यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि माप वांछित अवस्था में कमजोर स्थिर प्रोटीन (या प्रोटीन क्षेत्रों) से प्राप्त होते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, पिछले एक अध्ययन से पता चला है कि विभिन्न भंडारण स्थितियों, जैसे कि ठंड और लियोफिलाइजिंग, के परिणामस्वरूप अलग-अलग एएसवाईएन मोनोमर अनुरूपताएं हुईं और यह कि एसआईएन मोनोमर विरूपण पहनावा10 पर नमूना हैंडलिंग के संभावित प्रभाव को चिह्नित करना महत्वपूर्ण है। दरअसल, एचडीएक्स-एमएस माइक्रोसेकंड से कम से कम महीनों तक गतिशील सीमा के साथ, इस तरह के विरूपण गड़बड़ी का एक अत्यधिक संवेदनशील उपाय है। इसके अलावा, यदि केवल एएसवाईएन मोनोमर का कड़ाई से अध्ययन किया जाता है, तो निस्पंदन को अवांछित ऑलिगोमर्स और फाइब्रिल को हटाने की दृढ़ता से सलाह दी जाती है जो भंडारण या हैंडलिंग पर नमूने में बन सकते हैं। इसके अलावा, एचडीएक्स-एमएस बफर को वांछित पीएच या पीडी के 0.05 के भीतर कसकर नियंत्रित करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि कोई भी विसंगतियां विनिमय की आंतरिक दर को काफी प्रभावित करेंगी और अवांछित त्रुटियों को जन्म देंगी। यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि पीएच, तापमान या नमक संरचना में भिन्न किसी भी प्रोटीन के लिए समाधान की स्थिति के बीच तुलना आंतरिक दर को बदल देगी। इसलिए, इन आंकड़ों को आगे सुधार की आवश्यकता होगी, जैसे कि पीएच समायोजन कारक35 या अनुभवजन्य सुधार कारक 8,30 को लागू करना।

इंस्ट्रूमेंटेशन के संदर्भ में, कोई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिस्टम नहीं हैं जो मिलीसेकंड एचडीएक्स-एमएस डेटा के अधिग्रहण की अनुमति देते हैं। कई शोध समूहों ने कुछ प्रोटीनों के तेजी से विनिमय कैनेटीक्स को पकड़ने के लिए शमन-प्रवाह प्रणाली 13,15,36 से माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स 37,38,39 तक अपनी प्रणालियां विकसित की हैं। मिलीसेकंड टाइमस्केल एचडीएक्स-एमएस डेटा प्राप्त करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक अन्य विधि को समय विस्तार विधि40,41 के रूप में जाना जाता है, जिससे एक्सचेंज कैनेटीक्स को धीमा करने के लिए बफर का पीएच कम हो जाता है। हालांकि, यह विधि एएसवाईएन (या किसी भी कमजोर स्थिर प्रोटीन विशेषताओं) पर लागू नहीं होती है क्योंकि (1) पीएच को कम करने से प्रोटीन के चार्ज घनत्व में काफी बदलाव होता है और एकत्रीकरण 8,42 की दर बढ़ जाती है, और (2) एएसवाईएन अनुरूपक केवल मेटा-स्थिर होते हैं और इन पीएच परिवर्तनों से परेशान होने की संभावना होती है। इन कारणों से, मोनोमेरिक एसिन रचनाओं का अध्ययन करते समय एचडीएक्स-एमएस बफर में एक सुसंगत पीएच बनाए रखने की सिफारिश की जाती है, जब तक कि शारीरिक रूप से प्रासंगिक न हो, और एक मिलीसेकंड लेबलिंग उपकरण को नियोजित करें।

अधिकांश एएसवाईएन मोनोमर पूरी तरह से 1 एस के भीतर आदान-प्रदान करते हैं, और अधिक से अधिक, 7.4 के शारीरिक रूप से प्रासंगिक पीएच (प्रेसिनैप्स पर इंट्रासेल्युलर साइटोसोलिक स्थितियों के प्रतिबिंबित) पर ड्यूटेरियम (चित्रा 3) के साथ पूरी तरह से आदान-प्रदान करने में लगभग 15 एस लगते हैं। पारंपरिक एचडीएक्स-एमएस सिस्टम का उपयोग करना, 30 एस से शुरू करना उचित नहीं है क्योंकि एचडीएक्स-एमएस डेटा विनिमय प्रतिक्रिया के पठार के अनुरूप होगा, जो कोई उपयोगी रचनात्मक जानकारी प्रदान नहीं करता है। हालांकि, मिलीसेकंड एचडीएक्स उपकरण (50 एमएस के "मृत समय" के अनुरूप) की माप की निचली सीमा पीएच 7.4 पर एएसवाईएन मोनोमर के लिए ~ 25% पूरा होने से विनिमय प्रतिक्रिया की निगरानी को सक्षम बनाती है। इसने हमें गतिज अपटेक वक्र के बहुमत पर कब्जा करने की अनुमति दी। समीकरण 1 के लिए ड्यूटेरियम अपटेक वक्र को फिट करना महत्वपूर्ण गतिज जानकारी प्रदान करता है; यह मनाया दर स्थिर, के ओबीएस के अनुमान से मेल खाती है। जबकि यहां कवर नहीं किया गया है, एकत्रीकरण कैनेटीक्स प्रयोगों को पूरा करना और एचडीएक्स-एमएस प्रयोगों के समान समाधान स्थितियों के तहत एएसवाईएन के फाइब्रिल आकृति विज्ञान की जांच करना संभव है क्योंकि एचडीएक्स-एमएस बफर8 की एक विस्तृत श्रृंखला के अत्यधिक सहिष्णु है। इस प्रकार, उदाहरण के लिए, एचडीएक्स-एमएस प्रयोग से केओबीएस को एकत्रीकरण प्रयोगों के परिणामों के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है ताकि अंतर्दृष्टि प्राप्त की जा सके जिसमें कुछ एकत्रीकरण व्यवहार और फाइब्रिल आकृति विज्ञान के लिए सबसे अधिक प्रवण हैं।

अंतर एचडीएक्स-एमएस प्रयोगों के सरल मामले के लिए, जहां दो या दो से अधिक स्थितियों या प्रोटीन वेरिएंट की तुलना की जानी है, फिट अपटेक वक्र के तहत क्षेत्र को प्रत्येक राज्य के लिए एकीकृत किया जा सकता है और एक दूसरे की तुलना में। इस अध्ययन में, राज्य ए और राज्य बी के लिए उत्थान क्षेत्रों की तुलना संरचनात्मक संकल्प के दो अलग-अलग स्तरों पर की गई थी: पेप्टाइड रिज़ॉल्यूशन और एमिनो एसिड रिज़ॉल्यूशन, जिनमें से दोनों में अलग-अलग ताकत और चुनौतियां हैं। उदाहरण के लिए, पेप्टाइड रिज़ॉल्यूशन डेटा कच्चे वर्णक्रमीय डेटा को अधिक बारीकी से प्रतिबिंबित करता है और कम से कम प्रसंस्करण से गुजरा है। हालांकि, "चपटा" एमिनो एसिड रिज़ॉल्यूशन डेटा पेप्टाइड और सॉफ्ट-विखंडन जानकारी दोनों को अलग-अलग अनमर्जेबल आउटपुट के बजाय एक आउटपुट में जोड़ने की अनुमति देता है और अंततः, डेटा को उच्चतम संरचनात्मक रिज़ॉल्यूशन पर प्रस्तुत करता है। एचडीएक्स लेबलिंग के मास स्पेक्ट्रोमेट्री डिटेक्शन की एक सीमा अमीनो एसिड रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने की चुनौती है। जबकि "नरम-विखंडन" तकनीक, जैसे इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण पृथक्करण (ईटीडी), इलेक्ट्रॉन कैप्चर पृथक्करण (ईसीडी), और पराबैंगनी फोटोडिसोसिएशन (यूवीपीडी), उच्च संकल्प उत्पन्न करने में प्रभावी साबित हुए हैं, वे चुनौतीपूर्ण, अप्रत्याशित और अक्षम 30,43,44,45,46,47,48 बने हुए हैं।

अन्य संरचनात्मक तकनीकों की तुलना में, मिलीसेकंड एचडीएक्स-एमएस में उच्च संरचनात्मक और लौकिक संकल्पों पर मोनोमेरिक एसिन की रचनात्मक गतिशीलता को कैप्चर करने का अनूठा लाभ है। चूंकि मोनोमर के तेजी से विनिमय कैनेटीक्स अब एक सीमित कारक नहीं हैं, इसलिए विभिन्न उत्परिवर्तनों, पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों, नमक घटकों और सांद्रता और शारीरिक पीएच पर बाध्यकारी भागीदारों के साथ मोनोमेरिक एएसवाईएन पर आगे के अध्ययन किए जा सकते हैं। कार्यात्मक अध्ययनों के साथ एचडीएक्स-एमएस परिणामों को सहसंबंधित करना, जैसे कि एकत्रीकरण कैनेटीक्स और फाइब्रिल आकृति विज्ञान, अनुरूपकों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं जो या तो सामान्य सेलुलर फ़ंक्शन को बढ़ावा देते हैं या रोग प्रवण होते हैं। आखिरकार, यह अनुमान लगाया जाता है कि इस तरह के मिलीसेकंड एचडीएक्स-एमएस लक्षित दवाओं की खोज के लिए महत्वपूर्ण हो सकते हैं जो विशिष्ट शारीरिक रूप से सहन किए गए अनुरूपों को स्थिर करते हैं।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

एनएस विश्वविद्यालय परिषद डायमंड जुबली छात्रवृत्ति द्वारा वित्त पोषित है। जेजेपी को यूकेआरआई फ्यूचर लीडर्स फैलोशिप [अनुदान संख्या: एमआर / टी 02223 एक्स / 1] द्वारा समर्थित किया गया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column  Waters Corporation 186002346 Analytical column
Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv VWR 20060.420 For LC mobile phases
CaCl2 Sigma Aldrich C5670 Salt for HDX buffers
Chronos Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) 667006090 Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell
Deuterium chloride Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-2-50 For HDX labelling buffers
Deuterium oxide (99.9% D2O) Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-4 Deuterated water
DynamX 3.0 Waters Corporation 176016027 Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation
Enzymate BEH Pepsin Column Waters Corporation 186007233 Pepsin digestion column
Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade Fisher Scientific 10596814 For LC mobile phases
Guanidinium hydrochloride Sigma Aldrich RDD001-500G Chaotrope/Denaturant
HDfleX University of Exeter N/A https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982
KCl Sigma Aldrich P3911 Salt for HDX buffers
LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot Waters Corporation 725000637 Autosampler robot
Leucine enkephalin Waters Corporation 186006013 For mass spectrometry lockspray calibration.
MassLynx Waters Corporation 667004007 Software controlling inlet methods and mass spectrometer
Maximum recovery vials Waters Corporation 600000670CV 100 pack including caps - used for quench tray in LEAP HDX-2
MgCl2 Sigma Aldrich M8266 Salt for HDX buffers
Millipore 0.22 µm syringe filters Millipore N9CA7069B Syringe filters
ms2min Applied Photophysics Ltd N/A fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument
NaCl Sigma Aldrich S9888 Salt for HDX buffers
Peltier temperature controller LEAP Technologies Inc. HP115-COOL/D Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.
ProteinLynx Global Server 3.0 Waters Corporation 715001030 Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.
Reagent pot caps Waters Corporation 186004632 100 pack
Reagent pots for LEAP HDX-2 Waters Corporation 186001420 100 pack excluding caps - used for buffers in LEAP HDX-2
Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-57 For HDX labelling buffers
Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) Amicon (Merck Sigma Aldrich) UFC5003 Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.
Synapt G2-Si mass spectrometer Waters Corporation 176850035 Mass spectrometer
Total recovery vials Waters Corporation 600000671CV 100 pack including caps - used for labelling tray in LEAP HDX-2
Tris-HCl Sigma Aldrich T3253-250G Buffer
Trizma base Sigma Aldrich T60040-B2005 Buffer
Urea Sigma Aldrich U5378-1KG Chaotrope/Denaturant
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column  Waters Corporation 186004623 Trap desalting column

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 184 अल्फा-सिन्यूक्लिन आंतरिक विकार मिलीसेकंड हाइड्रोजन /
ड्यूटेरियम-एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री शारीरिक स्थितियों के तहत अल्फा-सिन्यूक्लिन संरचनात्मक गतिशीलता के अध्ययन के लिए
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Seetaloo, N., Phillips, J. J. Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions. J. Vis. Exp. (184), e64050, doi:10.3791/64050 (2022).

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