Isolierung von Monozyten-Makrophagen-Linienzellen aus Rattenknochen mittels sekundärer Adhärenzmethode
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von BMMs aus SD-Ratten vor, das als sekundäre Adhärenzmethode bezeichnet wird.
Abstract
Mit einer Abnahme der Knochenmineraldichte brechen Knochen eher, was sich negativ auf die Lebensqualität eines Patienten auswirkt. Das Wachstum und die Entwicklung von Knochen werden hauptsächlich durch Osteoblasten und Osteoklasten reguliert. Es ist allgemein anerkannt, dass Osteoklasten aus Monozyten-Makrophagen-Zellen (BMMs) des Knochenmarks gewonnen werden. BMMs und andere hämatopoetische Stammzellen befinden sich in der Knochenmarkhöhle. Daher ist die Isolierung einzelner stabiler BMMs aus verschiedenen und heterogenen Zellpopulationen eine große Herausforderung. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von BMMs aus SD-Ratten vor, das als sekundäre Adhärenzmethode bezeichnet wird. Adhärent Zellen, die für 24-48 h in Primärkultur kultiviert wurden, wurden gesammelt. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass etwa 37,94% der Zellen CD11b / c + (Monozyten-Makrophagen-Oberflächenantigen) waren. Tartratresistente Säurephosphatase (TRAP)-Färbung und Western-Blot-Analyse zeigten, dass BMMs in vitro in Osteoklasten differenzieren konnten. Die oben genannten Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die sekundären Adhärenzzellen als geeignetes zelluläres Modell für die Osteoklastendifferenzierungsforschung angesehen werden könnten.
Introduction
Es wurde berichtet, dass Monozyten-Makrophagen-Linienzellen, die im Knochenmark existieren, sich in Blutmonozyten und Gewebemakrophagendifferenzieren können 1,2. Die oben genannten Zellen, die sich in Osteoklasten differenzieren können, um das Knochenwachstum und die Knochenentwicklung auszugleichen, werden häufig als Zellmodell verwendet, um Osteoklasten in vivo 3,4 zu induzieren. Knochenmark ist ein spezielles Gewebe, das verschiedene Arten von Zellen enthält, zu denen unter anderem mesenchymale Stammzellen des Knochenmarks, Monozyten-Makrophagenzellen (BMMs), hämatopoetische Stammzellen, Endothelzellen und Immunzellen gehören. Tatsächlich deuteten mehrere frühere Studien darauf hin, dass sich adhärente Zellen, die aus der Knochenmarkhöhle des langen Knochens strömten, in Osteoblasten, Osteoklasten, Chondrozyten oder Adipozyten 5,6,7,8 differenzieren konnten. Obwohl verschiedene Isolations- und Kulturmethoden verwendet wurden, um verschiedene homogene Zellpopulationen herzustellen, gibt es immer noch große Herausforderungen bei der Isolierung und Kultivierung von BMMs aus einer Vielzahl verschiedener Zelltypen.
Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um mononukleäre Makrophagen (BMSCs) des Knochenmarks zu extrahieren. Die meisten dieser Methoden sind jedoch komplex 9,10,11. Zum Beispiel erfordert die Dichtegradientenzentrifugation ein spezielles Kit und der Betrieb ist zeitaufwendig und umständlich. Diese Methode eignet sich zur Isolierung von BMMs aus hochvolumigen Blutproben, jedoch nicht aus Knochenmarkproben 9,12,13. Darüber hinaus ist die Extraktion von Gewebeproben mittels Kollagenase-Verdauung ein komplexes und zeitaufwendiges Verfahren; Diese Methode wird nicht für die Isolierung von BMMs aus Knochenmarkproben14,15 empfohlen. Obwohl die Flusstrennung zu hochreinen Monozyten-/Makrophagenpopulationen führen kann, erfordert sie sehr große Stichprobengrößen und hohe Anforderungen an Instrumente und Ausrüstung10,16. Darüber hinaus ist die Mikroperlenanreicherungsmethode extrem teuer und in einem allgemeinen Labor nicht durchführbar17.
Daher wurde in der aktuellen Studie eine bequeme, schnelle und kostengünstige Methode zur Isolierung mononukleärer Makrophagen aus dem Knochenmark vorgeschlagen. Knochenmarkzellen, die für verschiedene Zeitpunkte hafteten, wurden verwendet, um BMMs mit einer sekundären Adhärenzmethode zu isolieren. BMMs, die mit der oben genannten Methode extrahiert wurden, könnten die Bildung von Osteoklasten in vitro induzieren und so ein einfaches und bequemes Zellmodell für die zukünftige Untersuchung von Osteoporose in vitro liefern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Osteoklasten sind einer der bedeutendsten Zelltypen, die am Auftreten und der Entwicklung von Knochenerkrankungen beteiligt sind, sowie eines der Hauptobjekte der Knochenkrankheitsforschung20. Monozyten/Makrophagen können sich in Osteoklasten differenzieren. Da mononukleäre Makrophagen (RAW264.7-Zellen) zu teuer in der Anschaffung sind und während der Kultur leicht aktiviert werden können, ist es schwierig, In-vitro-Differenzierungsexperimente mit dieser Zelllinie durchzuführen. Obwo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation der Provinz Zhejiang (Förderkennzeichen) unterstützt. LY19H060001) und das Zhejiang Traditional Chinese Medicine Science and Technology Plan Project (Nr. 2022ZB093).
Materials
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
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