Monosit-Makrofaj Soy Hücrelerinin Sıçan Kemiklerinden İkincil Aderans Yöntemi ile İzolasyonu
Summary
Burada, BMM’lerin SD sıçanlardan izolasyonu için ikincil aderans yöntemi olarak adlandırılan bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Kemik mineral yoğunluğunun azalmasıyla, kemiklerin kırılma olasılığı daha yüksektir, bu nedenle hastanın yaşam kalitesini olumsuz yönde etkiler. Kemiklerin büyümesi ve gelişmesi esas olarak osteoblastlar ve osteoklastlar tarafından düzenlenir. Osteoklastların kemik iliği monosit-makrofaj hücrelerinden (BMM’ler) türetildiği yaygın olarak kabul edilmektedir. BMM’ler ve diğer hematopoetik kök hücreler kemik iliği boşluğunda bulunur. Bu nedenle, tek kararlı BMM’leri farklı ve heterojen hücre popülasyonlarından izole etmek büyük bir zorluktur. Burada, BMM’lerin SD sıçanlardan izolasyonu için ikincil aderans yöntemi olarak adlandırılan bir protokol sunuyoruz. Primer kültürde 24-48 saat kültüre alınan yapışık hücreler toplandı. Akım sitometrik analiz, hücrelerin yaklaşık% 37.94’ünün CD11b / c + (monosit-makrofaj yüzey antijeni) olduğunu göstermiştir. Tartarat dirençli asit fosfataz (TRAP) boyama ve batı leke analizi, BMM’lerin in vitro osteoklastlara farklılaşabileceğini göstermiştir. Yukarıdaki bulgular, sekonder aderans hücrelerinin osteoklast farklılaşma araştırması için uygun bir hücresel model olarak düşünülebileceğini düşündürmektedir.
Introduction
Kemik iliğinde bulunan monosit-makrofaj soy hücrelerinin kan monositlerine ve doku makrofajlarına farklılaşabileceği bildirilmiştir 1,2. Kemik büyümesini ve gelişimini dengelemek için osteoklastlara farklılaşabilen yukarıdaki hücreler, in vivo 3,4 osteoklastlarını indüklemek için yaygın olarak bir hücre modeli olarak kullanılır. Kemik iliği, kemik iliği mezenkimal kök hücreleri, kemik iliği monosit-makrofaj hücreleri (BMM’ler), hematopoetik kök hücreler, endotel hücreleri ve bağışıklık hücrelerini içeren ancak bunlarla sınırlı olmayan birkaç farklı hücre türü içeren özel bir dokudur. Aslında, önceki birkaç çalışma, uzun kemiğin kemik iliği boşluğundan dışarı fırlayan yapışkan hücrelerin osteoblastlara, osteoklastlara, kondrositlere veya adipositlere 5,6,7,8 olarak farklılaşabileceğini öne sürdü. Farklı homojen hücre popülasyonları üretmek için farklı izolasyon ve kültür yöntemleri kullanılmış olsa da, BMM’leri çeşitli farklı hücre tiplerinden izole etmek ve kültürlemek için hala büyük zorluklar vardır.
Kemik iliği mononükleer makrofajlarını (BMSC’ler) çıkarmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin çoğunluğu karmaşıktır 9,10,11. Örneğin, yoğunluk gradyanı santrifüjleme özel bir kit gerektirir ve işlem zaman alıcı ve hantaldır. Bu yöntem, BMM’lerin yüksek hacimli kan örneklerinden izole edilmesi için uygundur, ancak kemik iliği örneklerinden 9,12,13 için uygun değildir. Ek olarak, kollajenaz sindirimi kullanarak doku örneklerinin çıkarılması karmaşık ve zaman alıcı bir prosedürdür; BMM’lerin kemik iliği örneklerinden izolasyonu için bu yöntem önerilmez14,15. Ek olarak, akış ayrımı yüksek oranda saflaştırılmış monosit/makrofaj popülasyonlarına neden olabilse de, çok büyük numune boyutları ve yüksek cihaz ve ekipman gereksinimleri gerektirir10,16. Ek olarak, mikroboncuk zenginleştirme yöntemi son derece pahalıdır ve genel bir laboratuvarda uygulanabilir değildir17.
Bu nedenle, mevcut çalışmada, mononükleer makrofajların kemik iliğinden izole edilmesi için uygun, hızlı ve ucuz bir yöntem önerilmiştir. Farklı zaman noktaları için yapıştırılan kemik iliği hücreleri, ikincil bir aderans yöntemi kullanılarak BMM’leri izole etmek için kullanıldı. Yukarıdaki yöntemle ekstrakte edilen BMM’ler, in vitro osteoklastların oluşumunu indükleyebilir, böylece in vitro osteoporozun gelecekteki çalışması için basit ve kullanışlı bir hücre modeli sağlayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Osteoklastlar, kemik hastalıklarının ortaya çıkmasında ve gelişmesinde rol oynayan en önemli hücre tiplerinden biridir ve kemik hastalığı araştırmalarının birincil hedeflerinden biridir20. Monosit / makrofajlar osteoklastlara farklılaşabilir. Mononükleer makrofajlar (RAW264.7 hücreleri) satın almak için çok pahalı olduğundan ve kültür sırasında kolayca aktive edildiğinden, bu hücre hattını kullanarak in vitro farklılaşma deneyleri yapmak zordur. Kemik il…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı tarafından desteklenmiştir (hibe no. LY19H060001) ve Zhejiang Geleneksel Çin Tıbbı Bilim ve Teknoloji Planı Projesi (no. 2022ZB093).
Materials
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
References
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).
- Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity. Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
- Zhou, X., et al. Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells. Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).
- Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).
- Li, Z., MacDougald, O. A. Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity. Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).
- Horowitz, M. C., et al. marrow adipocytes. Adipocyte. 6 (3), 193-204 (2017).
- Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice. Journal of Visualized Experiments. (131), e56750 (2018).
- Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).
- Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).
- Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).
- Yu, Y. R., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).
- Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes. Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).
- Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).
- Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
- Higashi, S. L., et al. Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology. Journal of Visualized Experiments. (163), e61657 (2020).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759 (2008).
- Yin, Z., et al. Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways. European Journal of Pharmocology. 859, 172550 (2019).
- Liu, F., et al. LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss. Redox Biology. , (2021).
- Jin, X., et al. Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).
