研究鞘氨醇1-磷酸受体结构和信号通路的管道

Summary

S1P通过S1P受体（S1PRs）亚家族发挥其多样化的生理作用。这里描述了一个管道来阐述S1PR的结构和功能。

Abstract

溶血磷脂（LPL）是生物活性脂质，包括鞘氨醇1-磷酸（S1P），溶血磷脂酸等。S1P是细胞膜中鞘脂的代谢产物，是表征最好的LPL之一， 通过 鞘氨醇1-磷酸受体（S1PRs）介导的信号通路调节各种细胞生理反应。这意味着S1P-S1PR信号系统是疾病（包括多发性硬化症（MS），自身免疫性疾病，癌症，炎症甚至COVID-19）的显着潜在治疗靶点。S1PR是A类G蛋白偶联受体（GPCR）家族的一小部分，由五种亚型组成：S1PR1，S1PR2，S1PR3，S1PR4和S1PR5。然而，缺乏详细的结构信息阻碍了靶向S1PR的药物发现。在这里，我们应用冷冻电子显微镜方法求解了S1P-S1PR复合物的结构，并利用基于细胞的功能测定阐明了活化，选择性药物识别和G蛋白偶联的机制。其他溶酶磷脂受体（LPLR）和GPCR也可以使用这种策略进行研究。

Introduction

鞘氨醇-1-磷酸（S1P）是细胞膜中鞘脂的代谢产物，是一种无处不在的溶血磷脂信号分子，涉及各种生物活性，包括淋巴细胞运输，血管发育，内皮完整性和心率^1，2，3。S1P通过五种S1P受体亚型（S1PRs 1-5）发挥其多样化的生理作用;S1PR存在于各种组织中，对下游G蛋白表现出独特的偏好^4，5。S1PR1主要与Gi蛋白偶联，随后抑制cAMP的产生;S1PR2 和 S1PR3 与 Gi、Gq 和 G12/13 耦合，S1PR4 和 S1PR5 通过 Gi 和 G12/13⁶ 转换信号。

S1P-S1PR信号传导是多种疾病的关键治疗靶点，包括自身免疫性疾病⁷，炎症⁸，癌症⁹，甚至COVID-19¹⁰。2010年，芬戈莫德（FTY720）被批准为靶向S1PR治疗复发性多发性硬化症（MS）¹¹的同类药物。然而，它能够与除S1PR2以外的所有S1PR结合，而与S1PR3的非特异性结合导致大脑皮层水肿，血管和支气管收缩以及肺上皮渗漏¹²。作为增加治疗选择性的替代策略，已经产生了受体的亚型特异性配体。西波尼莫德（BAF312）于2019年被批准用于复发性MS治疗¹³;它有效地靶向S1PR1和S1PR5，而它对S1PR3没有亲和力，在临床实践中表现出较少的副作用¹⁴。2020年，美国食品和药物管理局授权奥扎尼莫特用于MS治疗¹⁵。据报道，臭氧莫德对S1PR1的选择性比S1PR5¹⁶高25倍。值得注意的是，在当前COVID-19大流行的背景下，已经发现靶向S1PR的激动剂药物可以通过使用免疫调节治疗技术来治疗^{COVID-19 17}。与芬戈莫德相比，奥扎尼莫德在降低COVID-19患者的症状方面显示出优越性，目前正在进行临床试验¹⁰。了解S1PR的结构基础和功能为开发选择性靶向S1PR¹⁸的药物奠定了重要基础。

许多技术用于研究生物大分子的结构信息，包括X射线晶体学，核磁共振（NMR）和电子显微镜（EM）。截至2022年3月，蛋白质数据库（PDB）上沉积了超过180，000个结构，其中大多数已通过X射线晶体学解析。然而，随着程轶凡和David Julius在2013年¹⁹日报道了TPRV1的第一个近原子分辨率结构（3.4 Å分辨率），冷冻电子显微镜（cryo-EM）已成为蛋白质结构的主流技术，EM PDB结构的总数超过10，000个。关键的突破领域是开发新的成像相机，称为直接电子检测相机和新的图像处理算法。在过去的十年中，冷冻电镜彻底改变了结构生物学和基于结构的药物发现²⁰.由于了解大分子复合物如何在活细胞中履行其复杂的作用是生物科学的中心主题，冷冻电镜有可能揭示动态分子复合物的构象，特别是对于跨膜蛋白²¹。G蛋白偶联受体（GPCRs）是跨膜蛋白的最大超家族，也是目前上市药物中30%以上的靶标²²。冷冻电镜的发展促成了GPCR-G蛋白复合物的高分辨率结构的爆发，从而能够确定药物设计²³中X射线晶体学分析仍然无法获得的“难处理”靶标的结构。因此，冷冻电镜应用提供了在接近原子分辨率²⁴的情况下确定近天然条件下GPCR三维结构的机会。冷冻电镜的进步使得可视化GPCR刺激或抑制的机制基础成为可能，并进一步有利于揭示GPCR靶向药物创造的新型结合位点²⁵。

依靠冷冻电镜技术的巨大进步，我们最近确定了激动的S1PR1-，S1PR3-和S1PR5-Gi信号复合物的结构^26，27。在人类中，S1PR存在于各种组织中，对下游G蛋白表现出独特的偏好^4，5。S1PR1主要与Gi蛋白偶联，随后抑制3’，5′-环磷酸腺苷（cAMP）的产生。S1PR3 和 S1PR5 也能够与 Gi^{6，28 耦}合。由于Gi偶联受体激活降低了cAMP²⁹的产生，因此引入了Gi抑制cAMP测定法来测量捕获功能改变^26，27的cAMP抑制作用。使用萤 火虫 荧光素酶的突变版本，其中插入了cAMP结合蛋白部分，该cAMP测定提供了一种简单可靠的方法，用于通过细胞内cAMP浓度³⁰的变化来监测GPCR活性。它是一种灵敏的非放射性功能测定，可用于监测各种GPCR的实时下游信号传导，用于药物发现目的³¹.

这里总结了解决S1PR的活化和药物识别模式的关键方法，主要包括冷冻电镜操作和Gi抑制cAMP测定。本文旨在为进一步探索GPCR的结构和功能提供全面的实验指导。

Protocol

1. S1PRs-G蛋白复合物的纯化 为了纯化人S1PRs-G蛋白复合物，将缺乏C端残基338-382的S1PR1的C1PR1的cDNA、在C末端用345-398截断的野生型S1PR5和野生型Gi1克隆到pFastBac1载体中，将野生型Gβ1和Gγ2的cDNA克隆到pFastBacdual载体中（材料表）。注意：S1PR的所有构建体还包含血凝素（HA）信号序列，后跟N端的Flag表位标签和C端的10倍他的标签。此外，将用于翻译T4溶菌酶（T4L）的合成D…

Representative Results

在冷冻S1PRs-Gi复合物的样品之前，需要通过尺寸排阻色谱（SEC）分离纯化的样品，并用凝胶过滤色谱进行分析。 图2 显示了以S1PR3-Gi复合物为例。均相GPCR-G蛋白复合物的峰分数通常位于大小排阻色谱的~10.5mL（图2A）。S1PR3-Gi配合物的SDS页面分析（图2B）揭示了对应于S1PR3，Gαi，Gβ和scFv16的理论条带的四个条带，因此表明该配…

Discussion

该协议描述了通过冷冻电镜测定S1PR结构的主要管道，并通过Gi介导的cAMP抑制测定法测量S1PR的活化效力。一些步骤对实验的成功至关重要。

为了纯化S1PR-Gi复合物，病毒的质量和 sf9 细胞的健康应该更加关注。受体的表达在较差 的sf9 细胞中显着降低。通过测量 sf9 细胞的直径来评估其健康状况。健康的 sf9 细胞的直径约为15μm。S1PRs-Gi复合物的产量受?…

Materials

0.05% trypsin-EDTA	GIBCO	Cat# 25300054
0.22 µM filter	Thermo Fisher Scientific	Cat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentrator	Thermo Fisher Scientific	Cat# 88533
6-well plate	Corning	Cat# 43016
96-well plate	Corning	Cat# 3917
Aprotinin	Sigma-Aldrich	Cat# 9087-70-1
Apyrase	NEB	Cat# M0398S
Baculovirus transfection reagent	Thermo Fisher Scientific	Cat# 10362100	For the preparation of P0 baculovirus
Benzamidine	Sigma-Aldrich	Cat# B6506
CHO-K1	ATCC	N/A
CHS	Sigma-Aldrich	Cat# C6512
CryoSPARC	Punjani, A., et al.,2017	https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coli	Thermo Fisher Scientific	Cat# EC0112
D-Luciferin-Potassium Salt	Sigma- Aldrich	Cat# 50227
DMSO	Sigma- Aldrich	Cat# D2438
EDTA	Thermo Fisher Scientific	Cat# S311-500
ESF921 cell culture medium	Expression Systems	Cat#  96-001
Excel	microsoft	N/A
F12 medium	Invitrogen	Cat# 11765
FBS	Cell Box	Cat# SAG-01U-02
Flag resin	Sigma- Aldrich	Cat# A4596
Forskolin	APExBIO	Cat# B1421
Gctf	Zhang, 2016	https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDN	Anatrace	Cat# GDN101
Gel filtration column	GE healthcare	Cat# 28990944
Gen5 3.11	BIO-TEK	N/A
Gentamicin	Solarbio	Cat# L1312
GloSensor cAMP assay kit	Promega	Cat# E1291	Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmid	Promega	Cat# E2301	Sensor plasmid
Grace’s medium	GIBCO	Cat# 11595030
GraphPad Prism 8	Graphpad	N/A
HBSS	Thermo Fisher Scientific	Cat# 88284
HEPES	Sigma- Aldrich	Cat# H4034
jetPRIME Reagent	Polyplus Transfection	Cat# 114-15	transfection reagent
Janamycin	Solarbio	Cat# K1030
LB medium	Invitrogen	Cat# 12780052
Leupeptin	Sigma-Aldrich	Cat# L2884
LMNG	Anatrace	Cat# NG310
MotionCor2	(Zheng et al., 2017)	https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCab	Thermo Fisher Scientific	Cat# 1121822
PBS	Invitrogen	Cat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs	GenScript	N/A
pFastBac1-Gαi	GenScript	N/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10	GenScript	N/A
pFastBacdual-Gβ1γ2	GenScript	N/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	Cat# K210003	For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kit	NEB	Cat# E0554S	For the preparation of plasmids
Quantifoil	Quantifoil	Cat# 251448
RELION-3.1	(Zivanov et al., 2018)	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNA	addgene	N/A
scFv16	Invitrogen	Cat# 703976
Sf9	Expression Systems	N/A
Siponimod	Selleck	Cat# S7179
sodium cholate	Sigma-Aldrich	Cat# C1254
Synergy H1 microplate reader	BIO-TEK	N/A
Synthetic T4L DNA (sequence)	N/A	N/A	Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga actggacaaagccattggtcgcaacaccaac ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg tactggaacttgggacgcttac
TCEP	Thermo Fisher Scientific	Cat# 77720
Tetracycline	Solarbio	Cat# T8180
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	N/A