スフィンゴシン1-リン酸受容体の構造とシグナル伝達経路を調べるパイプライン
Summary
S1Pは、S1P受容体(S1PR)サブファミリーを介して多様な生理効果を発揮する。ここでは、S1PR の構造と機能を説明するためのパイプラインについて説明します。
Abstract
リゾリン脂質(LPL)は、スフィンゴシン1-リン酸(S1P)、リゾホスファチジン酸などを含む生理活性脂質である。細胞膜におけるスフィンゴ脂質の代謝産物であるS1Pは、スフィンゴシン1-リン酸受容体(S1PR)によって媒介されるシグナル伝達経路 を介して 様々な細胞生理学的応答を調節する最も特徴的なLPLの1つである。これは、S1P-S1PRsシグナル伝達系が、多発性硬化症(MS)、自己免疫障害、癌、炎症、さらにはCOVID-19を含む障害の顕著な潜在的な治療標的であることを示唆した。クラスAのGタンパク質共役型受容体(GPCR)ファミリーの小さなサブセットであるS1PRは、S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4、およびS1PR5の5つのサブタイプで構成されています。しかし、詳細な構造情報の欠如は、S1PRを標的とする創薬を妨げる。ここでは、S1P-S1PRs複合体の構造を解明するためにクライオ電子顕微鏡法を適用し、細胞ベースの機能アッセイを用いて、活性化、選択的薬物認識、Gタンパク質結合のメカニズムを解明しました。他のリゾリン脂質受容体(LPLR)およびGPCRも、この戦略を用いて研究することができる。
Introduction
細胞膜におけるスフィンゴ脂質の代謝産物であるスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)は、リンパ球輸送、血管発達、内皮完全性、および心拍数1,2,3を含む様々な生物学的活性を含むユビキタスなリゾホスファチド性シグナル伝達分子である。S1Pは、5つのS1P受容体サブタイプ(S1PRs1〜5)を介して多様な生理学的効果を発揮する。S1PRは様々な組織に見られ、下流のGタンパク質に対して独特の嗜好を示す4,5。S1PR1は主にGiタンパク質と結合し、その後cAMP産生を阻害する。S1PR2 および S1PR3 は Gi、Gq、および G12/13 と結合され、S1PR4 および S1PR5 は Gi および G12/13 を介して信号を伝送します。
S1P-S1PRシグナル伝達は、自己免疫疾患7、炎症8、癌9、さらにはCOVID-1910を含む複数の疾患の重要な治療標的である。2010年、フィンゴリモド(FTY720)は、再発性多発性硬化症(MS)を治療するためのS1PRを標的とするクラス初の薬物として認可されました11。しかしながら、S1PR2を除く全てのS1PRsに結合することができるが、S1PR3への非特異的結合は、大脳皮質の浮腫、血管および気管支狭窄、ならびに肺上皮漏出をもたらす12。治療選択性を高めるための代替戦略として、受容体に対するサブタイプ特異的リガンドが産生されている。シポニモド(BAF312)は、再発MS治療のために2019年に承認されました13;S1PR1およびS1PR5を効果的に標的とするが、S1PR3に対する親和性はなく、臨床現場でより少ない副作用を示す14。2020年、米国食品医薬品局(FDA)はオザニモドをMS治療に承認しました15。オザニモドは、S1PR516よりもS1PR1に対して25倍大きい選択性を保持することが報告されている。特に、現在のCOVID-19パンデミックの文脈では、S1PRを標的とするアゴニスト薬が、免疫調節療法技術を使用してCOVID-19を治療するために利用され得ることが発見されている17。フィンゴリモドと比較して、オザニモドはCOVID-19患者の症状を軽減する上で優位性を示しており、現在臨床試験を受けています10。S1PRの構造的基礎と機能を理解することは、S1PRsを選択的に標的とする薬剤を開発するための重要な基盤を築く18。
生体高分子の構造情報を調べるには、X線結晶構造解析、核磁気共鳴(NMR)、電子顕微鏡(EM)など、多くの技術が用いられています。2022年3月現在、タンパク質データバンク(PDB)には18万以上の構造が堆積しており、そのほとんどはX線結晶構造解析によって解明されています。しかし、2013年にYifan ChengとDavid Juliusによって報告されたTPRV1の最初の原子分解能に近い分解能構造(3.4 Å分解能)19では、クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)がタンパク質構造の主流技術となり、EM PDB構造の総数は10,000を超えました。重要なブレークスルー分野は、直接電子検出カメラとして知られるイメージング用の新しいカメラと新しい画像処理アルゴリズムの開発です。Cryo-EMは、過去10年間で構造生物学と構造ベースの創薬に革命をもたらしました20。高分子複合体が生細胞内で複雑な役割を果たす方法を理解することは、生物科学の中心的なテーマであるため、クライオEMは、特に膜貫通タンパク質21について、動的分子複合体の立体構造を明らかにする可能性を秘めています。Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は、膜貫通タンパク質の最大のスーパーファミリーであり、現在市販されている医薬品の30%以上の標的である22。クライオEMの開発は、GPCR-Gタンパク質複合体の高分解能構造のバーストに貢献し、薬物設計におけるX線結晶学的解析にはまだアクセスできない「難治性」標的の構造決定を可能にした23。したがって、クライオEMアプリケーションは、原子分解能24に近いネイティブに近い条件下でGPCRの3次元構造を決定する機会を提供します。クライオEMの進歩により、GPCRの刺激または阻害の機構的基盤を視覚化することが可能になり、GPCR標的薬作成のための新規結合部位の解明にさらなる利益をもたらす25。
クライオEM技術の驚異的な進歩に依拠して、我々は最近、苦悶のS1PR1-、S1PR3-、およびS1PR5-Giシグナル伝達複合体の構造を特定した26,27。ヒトでは、S1PRは様々な組織に見出され、下流のGタンパク質に対して独特の嗜好を示す4,5。S1PR1は主にGiタンパク質と結合し、その後、3′,5′-環状アデノシン一リン酸(cAMP)産生を阻害する。S1PR3およびS1PR5は、Gi 6,28との結合も可能である。Gi共役型受容体活性化はcAMP29の産生を減少させるので、機能的変化を捕捉するためのcAMP阻害効果を測定するためにGi阻害cAMPアッセイが導入された26、27。cAMP結合タンパク質部分が挿入されたPhotinus pyralis lucifereraseの変異バージョンを使用して、このcAMPアッセイは、細胞内cAMP濃度の変化を介してGPCR活性をモニタリングするための簡単で信頼性の高い方法を提供する30。これは、高感度で非放射性の機能アッセイであり、創薬目的で広範囲のGPCRのリアルタイムの下流シグナル伝達をモニターするために適用することができる31。
ここでは、S1PRの活性化モードと薬物認識モードを解決する上で重要な方法の概要が提供され、主にクライオ-EM操作とGi阻害cAMPアッセイが含まれます。本稿は、GPCRの構造と機能をさらに探求するための包括的な実験的ガイダンスを提供することを目的としている。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、クライオEMによってS1PRの構造を決定し、Gi媒介cAMP阻害アッセイによってS1PRの活性化効力を測定するための一次パイプラインを記述する。いくつかのステップは、実験の成功に不可欠です。
S1PRs-Gi複合体を精製するためには、ウイルスの質およびsf9細胞の健康状態にもっと注意を払うべきである。受容体の発現は、貧弱なsf9細胞において?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S1PRs-Gi複合体のデータは、四川大学の華西クライオEMセンターと南方科技大学(SUSTech)のクライオEMセンターで収集され、四川大学のDuyu高性能コンピューティングセンターで処理されました。この研究は、中国自然科学財団(32100965からL.C.、32100988がW.Y.、31972916がZ.S.)と四川大学の専任ポスドク研究基金(2021SCU12003からL.C.)の支援を受けました。
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA | GIBCO | Cat# 25300054 | |
| 0.22 µM filter | Thermo Fisher Scientific | Cat# 42213-PS | |
| 100 kDa cut-off concentrator | Thermo Fisher Scientific | Cat# 88533 | |
| 6-well plate | Corning | Cat# 43016 | |
| 96-well plate | Corning | Cat# 3917 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | Cat# 9087-70-1 | |
| Apyrase | NEB | Cat# M0398S | |
| Baculovirus transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10362100 | For the preparation of P0 baculovirus |
| Benzamidine | Sigma-Aldrich | Cat# B6506 | |
| CHO-K1 | ATCC | N/A | |
| CHS | Sigma-Aldrich | Cat# C6512 | |
| CryoSPARC | Punjani, A., et al.,2017 | https://cryosparc.com/ | |
| DH5α competent E.coli | Thermo Fisher Scientific | Cat# EC0112 | |
| D-Luciferin-Potassium Salt | Sigma- Aldrich | Cat# 50227 | |
| DMSO | Sigma- Aldrich | Cat# D2438 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | Cat# S311-500 | |
| ESF921 cell culture medium | Expression Systems | Cat# 96-001 | |
| Excel | microsoft | N/A | |
| F12 medium | Invitrogen | Cat# 11765 | |
| FBS | Cell Box | Cat# SAG-01U-02 | |
| Flag resin | Sigma- Aldrich | Cat# A4596 | |
| Forskolin | APExBIO | Cat# B1421 | |
| Gctf | Zhang, 2016 | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | |
| GDN | Anatrace | Cat# GDN101 | |
| Gel filtration column | GE healthcare | Cat# 28990944 | |
| Gen5 3.11 | BIO-TEK | N/A | |
| Gentamicin | Solarbio | Cat# L1312 | |
| GloSensor cAMP assay kit | Promega | Cat# E1291 | Gi-inhibition cAMP assay kit |
| GloSensor plasmid | Promega | Cat# E2301 | Sensor plasmid |
| Grace’s medium | GIBCO | Cat# 11595030 | |
| GraphPad Prism 8 | Graphpad | N/A | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | Cat# 88284 | |
| HEPES | Sigma- Aldrich | Cat# H4034 | |
| jetPRIME Reagent | Polyplus Transfection | Cat# 114-15 | transfection reagent |
| Janamycin | Solarbio | Cat# K1030 | |
| LB medium | Invitrogen | Cat# 12780052 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | Cat# L2884 | |
| LMNG | Anatrace | Cat# NG310 | |
| MotionCor2 | (Zheng et al., 2017) | https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | |
| NanoCab | Thermo Fisher Scientific | Cat# 1121822 | |
| PBS | Invitrogen | Cat# 14190-144 | |
| pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs | GenScript | N/A | |
| pFastBac1-Gαi | GenScript | N/A | |
| pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10 | GenScript | N/A | |
| pFastBacdual-Gβ1γ2 | GenScript | N/A | |
| PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | Cat# K210003 | For the preparation of plasmids and P0 baculovirus |
| Q5 site-Directed Mutagenesis kit | NEB | Cat# E0554S | For the preparation of plasmids |
| Quantifoil | Quantifoil | Cat# 251448 | |
| RELION-3.1 | (Zivanov et al., 2018) | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion | |
| S1PRs cDNA | addgene | N/A | |
| scFv16 | Invitrogen | Cat# 703976 | |
| Sf9 | Expression Systems | N/A | |
| Siponimod | Selleck | Cat# S7179 | |
| sodium cholate | Sigma-Aldrich | Cat# C1254 | |
| Synergy H1 microplate reader | BIO-TEK | N/A | |
| Synthetic T4L DNA (sequence) | N/A | N/A | Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga actggacaaagccattggtcgcaacaccaac ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg tactggaacttgggacgcttac |
| TCEP | Thermo Fisher Scientific | Cat# 77720 | |
| Tetracycline | Solarbio | Cat# T8180 | |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A |
References
- Verstockt, B., et al. Sphingosine 1-phosphate modulation and immune cell trafficking in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. , 1-16 (2022).
- Rosen, H., Stevens, R. C., Hanson, M., Roberts, E., Oldstone, M. B. Sphingosine-1-phosphate and its receptors: structure, signaling, and influence. Annual Review of Biochemistry. 82, 637-662 (2013).
- Cartier, A., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate: Lipid signaling in pathology and therapy. Science. 366 (6463), 5551 (2019).
- Jozefczuk, E., Guzik, T. J., Siedlinski, M. Significance of sphingosine-1-phosphate in cardiovascular physiology and pathology. Pharmacological Research. 156, 104793 (2020).
- Kihara, Y., Maceyka, M., Spiegel, S., Chun, J. Lysophospholipid receptor nomenclature review: IUPHAR Review 8. British Journal of Pharmacology. 171 (15), 3575-3594 (2014).
- Bryan, A. M., Del Poeta, M. Sphingosine-1-phosphate receptors and innate immunity. Cellular Microbiology. 20 (5), 12836 (2018).
- Pelletier, D., Hafler, D. A. Fingolimod for multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 366 (4), 339-347 (2012).
- Obinata, H., Hla, T. Sphingosine 1-phosphate and inflammation. International Immunology. 31 (9), 617-625 (2019).
- Pyne, N. J., Pyne, S. Sphingosine 1-phosphate and cancer. Nature Reviews: Cancer. 10 (7), 489-503 (2010).
- Abu-Farha, M., et al. The role of lipid metabolism in COVID-19 virus infection and as a drug target. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3544 (2020).
- Chun, J., Kihara, Y., Jonnalagadda, D., Blaho, V. A. Fingolimod: lessons learned and new opportunities for treating Multiple Sclerosis and other disorders. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 149-170 (2019).
- Murakami, A., et al. Sphingosine 1-phosphate (S1P) regulates vascular contraction via S1P3 receptor: investigation based on a new S1P3 receptor antagonist. Molecular Pharmacology. 77 (4), 704-713 (2010).
- Cao, L., et al. Siponimod for multiple sclerosis. Cochrane Database of Systematic Reviews. 11, (2021).
- Scott, L. J. Siponimod: a review in secondary progressive Multiple Sclerosis. CNS Drugs. 34 (11), 1191-1200 (2020).
- Lamb, Y. N. Ozanimod: first approval. Drugs. 80 (8), 841-848 (2020).
- Scott, F. L., et al. Ozanimod (RPC1063) is a potent sphingosine-1-phosphate receptor-1 (S1P1) and receptor-5 (S1P5) agonist with autoimmune disease-modifying activity. British Journal of Pharmacology. 173 (11), 1778-1792 (2016).
- McGowan, E. M., Haddadi, N., Nassif, N. T., Lin, Y. Targeting the SphK-S1P-SIPR pathway as a potential therapeutic approach for COVID-19. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7189 (2020).
- O’Sullivan, C., Dev, K. K. The structure and function of the S1P1 receptor. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (7), 401-412 (2013).
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
- Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends in Biochemical Sciences. 40 (1), 49-57 (2015).
- Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
- Zhang, M., et al. Cryo-EM structure of an activated GPCR-G protein complex in lipid nanodiscs. Nature Structural & Molecular Biology. 28 (3), 258-267 (2021).
- Renaud, J. P., et al. Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (7), 471-492 (2018).
- Ishchenko, A., Gati, C., Cherezov, V. Structural biology of G protein-coupled receptors: new opportunities from XFELs and cryoEM. Current Opinion in Structural Biology. 51, 44-52 (2018).
- Yang, D., et al. G protein-coupled receptors: structure- and function-based drug discovery. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 7 (2021).
- Yuan, Y., et al. Structures of signaling complexes of lipid receptors S1PR1 and S1PR5 reveal mechanisms of activation and drug recognition. Cell Research. 31 (12), 1263-1274 (2021).
- Zhao, C., et al. Structural insights into sphingosine-1-phosphate recognition and ligand selectivity of S1PR3-Gi signaling complexes. Cell Research. 32 (2), 218-221 (2022).
- Xu, Z., et al. Structural basis of sphingosine-1-phosphate receptor 1 activation and biased agonism. Nature Chemical Biology. 18, 281-288 (2022).
- Liu, Y. F., Ghahremani, M. H., Rasenick, M. M., Jakobs, K. H., Albert, P. R. Stimulation of cAMP synthesis by Gi-coupled receptors upon ablation of distinct Galphai protein expression. Gi subtype specificity of the 5-HT1A receptor. Journal of Biological Chemistry. 274 (23), 16444-16450 (1999).
- Buccioni, M., et al. Innovative functional cAMP assay for studying G protein-coupled receptors: application to the pharmacological characterization of GPR17. Purinergic Signalling. 7 (4), 463-468 (2011).
- Wang, F. I., Ding, G., Ng, G. S., Dixon, S. J., Chidiac, P. Luciferase-based GloSensor cAMP assay: Temperature optimization and application to cell-based kinetic studies. Methods. , (2021).
- Audet, M., et al. Small-scale approach for precrystallization screening in GPCR X-ray crystallography. Nature Protocols. 15 (1), 144-160 (2020).
- Sgro, G. G., Costa, T. R. D. Cryo-EM grid preparation of membrane protein samples for single particle analysis. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 74 (2018).
- White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: from sample to structure. Journal of Visualized Experiments. (171), e62415 (2021).
- Thompson, R. F., Iadanza, M. G., Hesketh, E. L., Rawson, S., Ranson, N. A. Collection, pre-processing and on-the-fly analysis of data for high-resolution, single-particle cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 14 (1), 100-118 (2019).
- Fernandez-Leiro, R., Scheres, S. H. W. A pipeline approach to single-particle processing in RELION. Acta Crystallographica Section D. 73 (6), 496-502 (2017).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Brilot, A. F., et al. Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
- Scheres, S. H. Semi-automated selection of cryo-EM particles in RELION-1.3. Journal of Structural Biology. 189 (2), 114-122 (2015).
- Liu, S., et al. Differential activation mechanisms of lipid GPCRs by lysophosphatidic acid and sphingosine 1-phosphate. Nature Communications. 13 (1), 731 (2022).
- Duan, J., et al. Cryo-EM structure of an activated VIP1 receptor-G protein complex revealed by a NanoBiT tethering strategy. Nature Communications. 11 (1), 4121 (2020).
- DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
- Pradelles, P., Grassi, J., Chabardes, D., Guiso, N. Enzyme immunoassays of adenosine cyclic 3′,5′-monophosphate and guanosine cyclic 3′,5′-monophosphate using acetylcholinesterase. Analytical Chemistry. 61 (5), 447-453 (1989).
- Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. Journal of Biological Chemistry. 282 (14), 10576-10584 (2007).
