Summary
本プロトコルは、 in vivoでの遺伝子編集細胞の堅牢な生着のために最適化された造血幹および前駆細胞(HSPC)培養手順を記載しています。
Abstract
CRISPR/Cas9は、さまざまな遺伝子変異を修正するために広く採用されている、汎用性が高く効率的な遺伝子編集ツールです。造血幹および前駆細胞(HSPC)のin vitro での遺伝子操作の実現可能性により、HSPCは遺伝子治療の理想的な標的細胞になります。しかし、HSPCは、 ex vivo 培養において生着および多系統再増殖の可能性を適度に失う。本研究では、HSPCの生着を改善し、 in vivoで遺伝子改変細胞の数を増加させる理想的な培養条件について説明します。現在のレポートには、培地の種類、独自の低分子カクテルの補給、サイトカイン濃度、細胞培養プレート、培養密度など、最適化された in vitro 培養条件が表示されます。それに加えて、最適化されたHSPC遺伝子編集手順と、遺伝子編集イベントの検証が提供されます。 in vivo 検証のために、マウスレシピエントにおける遺伝子編集HSPC注入および生着後分析が表示されます。結果は、培養系がin vitroで機能的な造血幹細胞の頻度を増加させ、その結果 、in vivoで遺伝子編集細胞の強力な生着をもたらすことを実証しました。
Introduction
同種異系移植環境におけるヒト白血球抗原(HLA)マッチングドナーへのアクセスの難しさと、汎用性が高く安全な遺伝子工学ツールの急速な開発により、自家造血幹細胞移植(HSCT)は遺伝性血液疾患の治癒的治療戦略となっています1,2。自家造血幹および前駆細胞(HSPC)遺伝子治療には、患者のHSPCの収集、遺伝子操作、疾患の原因となる突然変異の修正、および遺伝子修正されたHSPCの患者への移植が含まれます3,4。ただし、遺伝子治療の成功結果は、移植可能な遺伝子改変移植片の品質に依存しています。HSPCの遺伝子操作ステップとエクスビボ培養は、長期造血幹細胞(LT-HSC)の頻度を低下させることにより移植片の品質に影響を与え、大量の遺伝子操作HSPCの注入を必要とします2,5,6。
SR1およびUM171を含むいくつかの低分子は、現在、臍帯血HSPCを堅牢に拡張するために使用されています7,8。成人HSPCの場合、動員で得られる細胞収量が高いため、堅牢な拡張は必要ありません。しかし、分離されたHSPCの幹細胞性をex vivo培養で保持することは、その遺伝子治療アプリケーションにとって非常に重要です。そこで、レスベラトロール、UM729、SR1(RUS)7の低分子を組み合わせて造血幹細胞(HSC)の培養濃縮に焦点を当てたアプローチを開発しています。最適化されたHSPC培養条件は、造血幹細胞の濃縮を促進し、その結果、in vivoでの遺伝子改変造血幹細胞の頻度が増加し、大量のHSPCを遺伝子操作する必要性を減らし、費用対効果の高い遺伝子治療アプローチを促進します8。
ここでは、HSPC培養のための包括的なプロトコルを、 in vivoでの遺伝子編集細胞の注入と分析とともに説明します。
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Protocol
免疫不全マウスでのin vivo実験は、インドのベロールにあるクリスチャン医科大学の研究所動物倫理委員会(IAEC)によって承認され、それに従って実施されました。顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)に動員された末梢血サンプルは、治験審査委員会(IRB)の承認を得た後、インフォームドコンセントで健康なヒトドナーから収集されました。
1.末梢血単核球(PBMNC)の単離とCD34 + 細胞の精製
- 以下の手順に従ってPBMNC分離を実行します。
注:インビトロHSPC培養および遺伝子編集には、少なくとも1 x 106 HSPC/グループから始めるのが理想的です。in vivo生着解析では、グループに8匹のマウスが含まれ、各マウスに少なくとも6 x 10 5個の細胞が注入されている場合、少なくとも5 x 106 HSPC/グループの開始細胞数が理想的です。手技に十分な数のPBMNC(~1 x 109)を得るには、20 mLの動員末梢血(mPB)から始めることをお勧めします。- mPBの回収後、20 mLのmPBを滅菌済みの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1:1の比率で希釈します。
注:G-CSF動員の効率は個人間で異なる可能性があるため9、したがって、20 mLの動員血液から得られるHSPCの数はドナーによって異なります。 - 10 mLの密度勾配培地(Lymphoprep、 材料表を参照)を50 mLチューブに加え、希釈した血液をチューブの側面に1:2の比率で層状にします。
注:希釈した血液を加えながら50 mLチューブを20°の角度で傾けると、Lymphoprepとの混合が防止され、遠心分離後の血液成分の明確な分離につながります。 - 室温(RT)で600 x g で30分間、加速速度1 m/s²、減速速度1 m/s²で遠心分離します。血清学的ピペットを使用して上層(血漿)を廃棄し、密度勾配培地層の上の間期(PBMNC)に存在するバフィーコートを採取します。
注意: 血清学的ピペットを使用して、チューブの側面でバフィーコートを静かに回転させて吸引します。顆粒球と赤血球の汚染を防ぐために、バフィーコートを吸引している間、より多くの間期を収集することは避けてください。 - PBMNCを新しい50 mLコニカルチューブに移し、細胞懸濁液を1xPBSで1:2の比率で希釈します。
注:バフィーコートを吸引しながら過剰の中間期が収集された場合は、細胞懸濁液を1x PBSで1:4の比率で希釈します。 - 細胞懸濁液を200 x g で室温、加速速度9 m/s²、減速速度7 m/s²で5分間遠心分離し、血清学的ピペットを使用して上清を廃棄します。30 mLの氷冷RBC溶解バッファー( 表7を参照)をペレットに加え、氷中で10分間インキュベートします。2分ごとにチューブを反転させて混ぜます。
- 加速速度9m/s²、減速速度7m/s²で室温で200× g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。手順 1.1.5.-1.1.6 を繰り返します。ペレットの発赤が消えるまで。ペレットを基礎培地(IMDM、 材料表を参照)で再懸濁し、ノイバウアーチャンバー10内でトリパンブルーを用いて細胞カウントを行う。
注:単離されたPBMNCは、CD34+ HSPCの精製に直ちに使用できます。 あるいは、PBMNCは、CD34+濃縮に必要なときにいつでも凍結保存および復活させることができます。凍結保存のために、5 x 108細胞を200 x gで5分間遠心分離し、IMDM:FBS:DMSO(材料表を参照)を含むクライオ培地4 mLを7:2:1の比率で加えます。 - バイアルを1°Cのクライオクーラーに移し、-80°Cで最大12時間保管します。クライオバイアルを液体窒素容器に移して保管し、長期保存します。
- mPBの回収後、20 mLのmPBを滅菌済みの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1:1の比率で希釈します。
- 凍結保存されたPBMNCを復活させます。
- クライオバイアルを37°Cの水浴中で<1分間穏やかに回転させて半解凍します。クライオバイアルの細胞懸濁液を、IMDMを含む50 mLチューブに1:10の比率で移します。
- 細胞懸濁液を200 x g で室温、加速速度9 m/s²、減速速度7 m/s²で5分間遠心分離し、血清学的ピペットを使用して上清を廃棄します。
- 以下の手順に従って、PBMNCからCD34+ 細胞を精製します。
- 2%ろ過されたウシ胎児血清(FBS)を含む滅菌1x PBSで精製バッファーを調製します。PBMNC細胞ペレットを 表1に従って緩衝液に再懸濁する。
注: バッファーは Ca++ および Mg++ を含まない必要があります。 - 新鮮または凍結保存されたPBMNCの1 x 10 8-5 x10 8細胞を含む細胞懸濁液を5 mLポリスチレン丸底チューブに移します(材料の表を参照)。
注:DNase( 材料の表を参照)を最終濃度100 μg/mLで細胞懸濁液に追加して、細胞の凝集を防ぎます。ヒトCD34ポジティブセレクションカクテルとデキストランラピッドスフィアを含む市販のCD34精製キットを使用しました( 材料の表を参照)。 - 市販のヒトCD34ポジティブセレクションカクテル( 材料表参照)を100 μL/mLの細胞濃度で添加し、穏やかに再懸濁します。
- RTで30分間インキュベートし、5分ごとに細胞懸濁液を静かに再懸濁します。市販のデキストランラピッドスフィア( 材料の表を参照)を50 μL/mL加え、穏やかに再懸濁します。
注意: デキストラン球を高速で5秒間ボルテックスして、粒子が均一に分散しているように見えてから、セルに追加します。 - RTで15分間インキュベートし、5分ごとに細胞懸濁液を静かに再懸濁します。細胞懸濁液を精製バッファーで総容量2.5 mLにし、穏やかに再懸濁します。
- チューブを市販の免疫磁気カラムフリー磁石( 材料の表を参照)に入れ、RTで5分間インキュベートします。インキュベーション後、磁石を反転させ、上清を1回の連続運動で廃棄します。
注:デキストランラピッドスフィアでタグ付けされたCD34+ 細胞は、磁場によってチューブの側面に引き付けられたままになります。チューブは2〜3秒間倒立位置に保持する必要があります。チューブの口からぶら下がっている滴を震えさせたり吸い取ったりしないでください。 - チューブを磁石から取り外し、2.5 mLの精製バッファーを追加します。手順1.3.6〜1.3.7を5回繰り返します。
注:精製バッファーの添加中は、磁石を反転させながら細胞が表面壁に付着する可能性があるため、チューブを鋭角に配置し、チューブを旋回させてバッファーを追加します。 - 5回の洗浄が完了したら、チューブを磁石から取り外し、4 mLの1x滅菌PBSを加え、細胞懸濁液を再懸濁します。細胞懸濁液を15 mLの遠沈管に移し、1x PBSで10 mLまで作ります。ノイバウアーチャンバー10内でトリパンブルーを用いて細胞カウントを行う。
- 200 x g で室温で5分間遠心分離し(加速度~9 m/s²、減速~7 m/s²)、上清をピペットで廃棄します。HSPCを培養するには、ステップ2.1で説明したように、細胞をHSPC培地に再懸濁します。
注:精製されたHSPCの過剰分は、HSPCをHSPC培養培地で12時間培養した後、市販の凍結保存培地( 材料の表を参照)で9 x 106 細胞/ mLの密度で凍結保存しました。
- 2%ろ過されたウシ胎児血清(FBS)を含む滅菌1x PBSで精製バッファーを調製します。PBMNC細胞ペレットを 表1に従って緩衝液に再懸濁する。
- 凍結保存されたHSPCを復活させます。
- クライオバイアルを37°Cの水浴中で<1分間、穏やかに旋回させて解凍します。クライオバイアルの細胞懸濁液を50 mLチューブに移します。
- 1x PBSに再懸濁した1%BSAを、絶えず攪拌しながら一滴ずつ加え、20mLまでします。加速速度9 m/s²、減速速度7 m/s²の室温で200 x g で5分間遠心分離し、血清学的ピペットを使用して上清を廃棄します。
- 手順 1.4.2 を繰り返します。1倍。HSPC培地に細胞を再懸濁し、ステップ2.1に記載の培養を行います。
2. 精製造血幹細胞の 体外 培養
- SFEM-IIとSCF(240 ng/mL)、FLT3(240 ng/mL)、TPO(80 ng/mL)、IL6(40 ng/mL)、および1x抗生物質抗真菌薬を使用して培地を調製します( 材料の表を参照)。
注:新たに調製した培地を強くお勧めします。ただし、培地は調製後4°Cで最大24時間保存できます。 - CD34+ ペレットを培地で再懸濁し、3 μLのRUSカクテル/ mLの培地(レスベラトロール、10 μM;UM729, 500 nM;ステムレジニン-1, 750 nM; 材料の表を参照されたい)、細胞を5%CO2と共に37°Cで培養した。
注:UM171(10 nm)は、HSPCステムネスの維持に同様の効果があるため、UM729(500 nM)の代わりに使用できます7。バイアルは2回以上凍結解凍することはできません。 - 最初に、精製した細胞を市販のデルタ表面処理6ウェルプレート(材料表を参照)に5 x 105/mLのコンフルエントで播種し、接着細胞を除去します。
- 6時間の精製後、懸濁液中の細胞を2 x 105 細胞/mLのコンフルエンシーで新しい6ウェルプレートに再播種します。
- 遺伝子編集の前にフローサイトメトリーを使用してHSPCのステム性を特徴付けます。
- フローサイトメトリー解析では、1 x PBSの100 μL中に1 x 105 細胞を採取し、CD34 PEを3 μL(75 ng)、CD133 FITCを4 μL(100 ng)、CD90 APCを4 μL(100 ng)加えます( 材料の表を参照)。
- チューブをRTで暗所で20分間インキュベートします。細胞を2 mLの1x PBS 2xで洗浄し、200 x g でRTで5分間遠心分離します。 上清をピペットで廃棄し、細胞ペレットを150 μLの1x PBSで再懸濁し、フローサイトメトリーで取得します。
注意: CD34 + 細胞の割合が<90%の場合は、手順1.3.7で洗浄回数を最大6回増やします。精製したHSPCを培地に播種し、6時間後に懸濁液中の細胞のみを回収します。ほとんどのCD34- 細胞は培養プレートに接着します。
3. 造血幹細胞の遺伝子編集
- ガイドRNA再構成を実行します。
注:CCR5遺伝子座を標的とするホスホロチオエート修飾を有する合成sgRNAは、市販の供給源から入手した( 材料の表を参照)。- 再構成するには、サーモミキサーを37°Cに設定し、1x TEバッファー( 材料表を参照)を37°Cで10分間予熱します。合成化学修飾sgRNAバイアルを11,000 x g で4°Cで1分間遠心分離します。
- 1.5 nMの凍結乾燥sgRNAを含むsgRNAバイアルに、15 μLの1x TEバッファーを加えると、最終濃度は100 pM/μLになります。 先端を角の周りに旋回させながら、5倍まで穏やかに再懸濁します。
- 最小限の振とうで37°Cのサーモミキサーで30〜40秒間インキュベートします。短時間スピンした後、15 μLのsgRNAを回収し、-80°Cで1 μlのアリコート(100 pM/μL)として保存し、将来最大1年間使用します。
注意: 凍結解凍を繰り返すことは避けてください。分注されたgRNAの最大1回の凍結融解サイクルが推奨されます。
- 以下の手順に従って核オフ化を実行します。
- 培養3日目に、ノイバウアー改良型細胞計数チャンバー10を用いて細胞を計数する。
- RNP調製(2 x 10 5細胞を核形成用)の場合、CCR5遺伝子を標的とするsgRNA1 μL(100 pM)を0.5 mLチューブに採取し、バイアルの底を穏やかに旋回させて2.65 μLのCas9(50 pM)を加えます。RTで10分間インキュベートします。
注:gRNA配列:(CCR5)TGACATCAATTATACATCGG。 - バッファー調製のために、市販のヌクレオフェクションキット( 材料表を参照)に付属のP3初代細胞溶液16.4 μLとサプリメント3.6 μLを加え、RTで10分間インキュベートします。培養培地を調製し(ステップ2.1)、ヌクレオフェクション前の培養プレートで37°Cでプレインキュベートします。
- 2 x 105 細胞をRTで5分間200 x g で遠心分離し、ペレットを乱すことなくピペットを使用して上清を穏やかに廃棄します。ステップ3.2.3で調製した20 μLのバッファーでペレットを再懸濁します。そしてそれを静かに再懸濁します。
- 気泡なしで細胞懸濁液を調製したRNP複合体と穏やかに混合する(ステップ3.2.2)。懸濁液を市販の核効果ストリップ(材料表参照)に移し、パルスコードDZ100を選択して、4D核フェクターを使用して細胞をエレクトロポレーションします(材料表を参照)。
注:バッファーおよびRNP成分を含む細胞懸濁液の最終容量は、27 μL/エレクトロポレーションを超えてはなりません。 - 実験対照のために、200 x gでRTで5分間遠心分離することにより、ペレット2 x 105未編集HSPCを、ステップ3.2.3で調製した20 μLのバッファーでペレットを再懸濁します。RNPコンプレックスなし。
- 100 μLのプレインキュベート培養培地(ステップ3.2.3.)をエレクトロポレーション細胞に加え、細胞をRTのヌクレオフェクションストリップに10分間乱さずに放置します。10分間のインキュベーション後、実験要件に従って内容物を培養プレートに移します。
注:このプロトコルは、標的特異的gRNAを使用した任意のゲノム遺伝子座の非相同末端結合(NHEJ)を介した標的破壊に適用できます。ステップ3.2.2にデュアルgRNAを含めることにより、大きな欠失を導入するために同じプロトコルを適用できます。11.さらに、RNPインキュベーションの10分後、ドナーテンプレート12が提供される場合、同じプロトコルを相同性指向性修復(HDR)ベースの遺伝子編集に使用することができる。このプロトコルは、AAVS1、疑似βグロビン、β-グロビン、およびCCR5遺伝子座7,8の標的破壊によって検証されています。
4. 造血幹細胞における遺伝子編集イベントの検証
- DNA抽出を実行します。
- ヌクレオフェクション後72時間後、ノイバウアーチャンバー内でトリパンブルーを用いて細胞計数を行う。DNA抽出のために1 x 105 遺伝子編集HSPCを収集します。
- 細胞を11,000 x gでRTで5分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を廃棄します。ペレットを1 mLの1x PBSで再懸濁し、遠心分離を繰り返して上清を廃棄します。ペレットに、1 x 105細胞用の20 μLのクイック抽出溶液(材料の表を参照)を追加し、ペレットを再懸濁します。
- 混合物を68°Cのサーモサイクラーで30分間インキュベートします。短時間スピンした後、混合物をサーモサイクラー中で98°Cで10分間インキュベートします。分光光度計13を用いて粗溶解液中のDNAの濃度を測定する。
- PCRにより遺伝子編集遺伝子座の増幅を行う。
- Primer3(材料の表を参照 )を使用して、400〜700 bpの範囲のアンプリコンサイズで二本鎖切断(DSB)部位にまたがる遺伝子座特異的プライマーを設計します(表2)。
注:Primer3は、PCRプライマーを設計するためのWebベースのオープンソースツールです。 - 表 3 に示すように反応混合物を調製し、 表4に記載されているサイクリング条件でサーモサイクラーを実行します。目的の遺伝子座の増幅を確認するには、5 μLのPCR産物を6倍のローディング色素と混合し、TAEバッファーを使用して作成した2%アガロースゲル電気泳動にロードします。
メモ: TAE バッファのコンポーネントを表 7 に示します。 - 100 Vで30〜40分間実行し、ゲルイメージングシステムを使用してアンプリコンを検出します( 材料の表を参照)。PCR精製メーカーのプロトコル( 材料表を参照)に従って、増幅されたPCR産物をクリーンアップします。
- ナノドロップ分光光度計を使用して精製PCR産物の濃度を測定します(材料の表を参照)。
- Primer3(材料の表を参照 )を使用して、400〜700 bpの範囲のアンプリコンサイズで二本鎖切断(DSB)部位にまたがる遺伝子座特異的プライマーを設計します(表2)。
- 以下の手順に従って、サンガーシーケンシングと遊離染料ターミネーター除去を実行します。
- 表5に示すように反応混合物を調製する。表6に記載されているサイクリング条件でサーモサイクラーを実行します。
- 10 μLのHighPrep DTR試薬( 材料表を参照)と40 μLの85%エタノールを1.5 mLチューブ内の10 μLのPCRサンプルに加え、約8x-10xの激しいピペッティングで混合します。
- 混合物をRTで5分間インキュベートし、1.5 mLチューブを磁気分離スタンドに5分間置きます。ピペットを使用して上清を除去し、100 μLの85%エタノールを加えます。
- 上清を廃棄し、手順4.3.3を繰り返します。1倍。マグネットスタンドから1.5 mLチューブを取り出し、サーモミキサーで37°Cで10分間インキュベートし、エタノールを乾燥させます。
- ビーズを40 μLのヌクレアーゼフリー水で激しく再懸濁し、RTで5分間インキュベートします。チューブを磁気分離スタンドに5分間置き、公開されたレポート14、15に従ってサンガーシーケンシングを実行します。
- ICE解析によるインデル周波数評価を実行する16.
- ICE分析にはSynthego( 材料表を参照)を使用してください。
- 編集済みおよび未編集のサンプルとgRNA配列のab1ファイルをアップロードし、分析をクリックしてインデルの頻度を取得します。
5. 遺伝子編集造血幹細胞移植
- 市販のNODシドガンママウス(NSG)17 およびNODを事前条件付けします。CG-KitW-41JTyr+PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/ThomJ (NBSGW)18 マウス( 材料表参照)を骨髄移植用。
- NSGマウスのプレコンディショニングには、6〜8週齢の雌マウスを選択し、盲検ランダム化によって対照群と編集群に分けます。
- NSGマウスをパイケージに入れ、HSPC移植の6〜8時間前に市販の照射器( 資料表参照)を用いて3.5Gyで照射する。
注:照射前にマウスの体重を量ることが推奨され、体重>20gのマウスに照射を行います。 - 6〜8週齢の男性と女性のNBSGWマウスを事前に調整するために、HSPC移植の48時間前に腹腔内(IP)注射を介してブスルファン( 材料の表を参照)を体重12.5 mg / kgの用量で注射します。.
注:ブスルファンコンディショニングは、マウス骨髄におけるヒトHSPCの生着を増加させ、遺伝子編集されたHSPCを大量に注入する必要性を減少させます19。コンディショニングのためのブスルファン用量の理想的な範囲は、体重の10 mg / kgから15 mg / kgの間です。.ブスルファンの投与量を増やすと、深刻な死亡率の問題が発生します。
- 骨髄移植用の細胞懸濁液を調製する。
- ニュークレオフェクションストリップで遺伝子編集されたHSPCを10分間インキュベートした後(ステップ3.2.7を参照)、細胞懸濁液を1x PBSの10 mLに移します。ノイバウアーの改良型細胞計数チャンバー10を用いて細胞を計数する。
- 1匹のマウスの注入では、200 x gでRTで5分間遠心分離することにより、1.5 mLチューブに6 x 105細胞をペレット化し、ペレットを乱すことなくピペットを使用して上清を穏やかに廃棄します。細胞ペレットを100 μLの1x PBSで再懸濁します。
- 以下の手順に従って、尾静脈注射によってHSPCを注入します。
- 調整済みのNSGまたはNBSGWマウスをマウス拘束具に入れます(資料表を参照)。
- マウスの尾を持ち、プラグをそっと押してマウスを拘束します。マウスの尾を70%エタノールでそっと拭きます。100 μLの細胞懸濁液を31 Gインスリンシリンジで吸引します。
注意: シリンジを軽くたたくか、プランジャーをそっと動かして、輸液製品の気泡を厳密に避けてください。 - 赤外線ランプからの光を30〜40秒間尾に向け、マウスの体の領域をティッシュペーパーのひだで覆います。針の斜角部分を左右の尾尾静脈に20°の角度でそっと挿入します。
- 左人差し指で尾を持ち上げて、シリンジで平面軸に維持します。プランジャーを押して、細胞懸濁液を静脈に注入します。ティッシュペーパーで穴を開けた部分の近くに穏やかな圧力をかけ、針を引き抜きます。
- 穏やかな圧力を30秒加えた後、マウスを拘束具から取り外し、ケージに移します。
6.短期生着の可能性の評価
- ヒトHSPC移植の4週間後、パスツールピペットを使用してヘパリン化チューブ内の眼窩静脈洞を介して血液を採取することにより、短期間の生着を評価します。
- サンプル収集前に、腹腔内(IP)注射を介してケタミン(90-120 mg / kg)およびキシラジン(8-12 mg / kg)製剤で動物を麻酔します。.
注意: 麻酔をかけたマウスの後肢にそっと圧力をかけ、感覚の喪失を確認します。 - 麻酔後、動物を腹側横臥状態に置き、マウスをそっとこすって目を開き、目の球がわずかに突き出るようにします。
- パスツールピペットを、ニクテーション膜の下の目の内側眼窩に30°〜45°の角度で静かに挿入します。パスツールピペットを適切な位置に置いた後、チューブにわずかな圧力を加え、チューブを穏やかに回転させ始めます。
注:眼窩後神経叢が穿刺されるとすぐに、血液は毛細管現象によってチューブに入ります。
- サンプル収集前に、腹腔内(IP)注射を介してケタミン(90-120 mg / kg)およびキシラジン(8-12 mg / kg)製剤で動物を麻酔します。.
- 50〜80μLの末梢血を採取した後、眼の内側眼窩からピペットを静かに引き出します。
- 眼窩の周りの出血を止めるには、まぶたを閉じ、ガーゼを使って穏やかな圧力をかけます。
- 細胞をそれぞれの抗体で染色し(表8)、RTで25〜30分間暗所で細胞をインキュベートします。
- 赤血球溶解の場合、細胞懸濁液に3 mLの1x 赤血球溶解バッファー(表7)を加え、氷中で10分間インキュベートします。
- 200 x g で室温で5分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を廃棄します。手順 6.4 を繰り返します。ペレットの発赤が消えるまで。
- 2 mLの1x PBSを加え、200 x g でRTで5分間遠心分離して、赤血球溶解に関連する細胞破片を除去します。
- 150 μLの1x PBSをペレットに加え、フローサイトメトリーのイムノフェノタイピングを進めて、生着したヒト細胞の割合を評価します7。
7.長期的な生着の可能性の評価
- マウスを安楽死させる。
- 16週目に移植マウスを生着解析のために100%CO2 窒息20 をマウスケージ内に1〜2分間導入して屠殺する。
- 心停止と呼吸停止、および後肢を穏やかにつまんで筋肉の動きがないことを確認して、安楽死を確認します。両方の条件が満たされている場合は、ケージからマウスを取り外します。
- ヒト細胞のキメラ性を評価するには、骨髄から細胞を収集します。
- 以下の手順に従って骨髄から細胞を分離します。
- 安楽死後、尿道の1 cm上に垂直に切開し、横隔膜の下1 cmまで伸ばします。切開部の角を水平に切り、腹部を大きく開きます。
- 大腿骨と脛骨を解剖し、ハサミを使用して大腿骨と脛骨に付着した軟組織を取り除きます。ティッシュペーパーでそっとこすり、メスを使用して0.2 mLの微量遠心チューブの底に直径0.5 cm以下の小さな穴を開けます。
- メスを使用して骨の近位端を取り除き、切断面を0.5 mL微量遠心チューブの穴に向けて骨を置きます。骨の入った0.5 mLチューブを、100 μLの滅菌1x PBSを含む1.5 mLチューブに入れます。
- 蓋を閉め、RTで滅菌条件下で1000 x g で3分間チューブを回転させ、骨髄腔が空の骨を含む0.5 mLチューブを廃棄します。骨髄を含む1.5 mL反応チューブに1 mLの1x PBSを加え、1 mLピペットを使用して細胞を約10倍以上に穏やかに再懸濁します。
- 1 mLの細胞懸濁液を、9 mLのRBC溶解バッファーを含む15 mLチューブに移します。細胞を氷中で7分間インキュベートし、2分ごとにチューブを穏やかに反転させます。
- 7分後、200 x g でRTで5分間、加速度9 m/s²、減速7 m/s²で遠心分離します。手順 7.2.5 を繰り返します。透明な淡い白色のペレットが観察されるまで。
- 10 mLの滅菌済み1x DPBSで細胞を再懸濁し、15 mLチューブ上の40 μm細胞ストレーナーを使用して骨髄細胞懸濁液をろ過します。細胞の損失を避けるために、2 mLの1x PBS 2xでセルストレーナーをすすぎます。
- 200 x g、RTで5分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を廃棄します。DNase-Iを含む10 mLのIMDMで細胞を100 μg/mLの作動濃度で再懸濁します。
- 1 x 106 単核球をFACSチューブに入れて、フローサイトメトリーによる生着解析を行います。生着した骨髄単核球の遺伝子編集頻度を評価するには、1 x 106 単核球を11,000 x g でRTで5分間ペレット化し、ピペットを使用して上清を廃棄します。
8.イムノフェノタイピング
- 骨髄細胞を1.5 μLの精製組換えヒトFcタンパク質( 材料の表を参照)で4°Cで15分間インキュベートしてから、抗体で染色します。
注:ここで使用されるヒトFcタンパク質は、IgGの受容体によって引き起こされる非特異的抗体染色をブロックするように処方されています。それにより、抗体標識7、21、22の特異性が高まる。標的細胞の抗体染色に先立って、抗体滴定を行う。マルチカラーフローサイトメトリー解析に取り組む際には、FMOコントロールとアイソタイプコントロールを含めることを強くお勧めします。 - フローサイトメーターでヒト細胞の生着の割合を決定するには、FACSチューブに1 x 106 単核球を採取し、 表8に記載されているように細胞を染色します。
- 細胞を暗所でRTで25〜30分間インキュベートし、RTで200 x g で5分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を廃棄します。
- フローサイトメーターで細胞を取得し、単核球の前方(FSC)および側方散乱(SSC)を使用して細胞集団(P1)をゲートし、細胞集団に応じて電圧を調整します。P1集団で50,000個の細胞イベントを取得します。
- マウス骨髄中のヒト白血球集団を分析するには、フローサイトメトリーデータ解析ソフトウェアを使用して、P1細胞集団からヒトCD45+ 細胞およびマウスCD45.1をゲートします( 材料の表を参照)。
- 次の式8を使用してヒト細胞の生着を計算します。
生着の割合=(%hCD45)/(%hCD45+%mCD45)×100。
注:人間の生着の閾値は、CD45に対して0.1%陽性であると考えられました。 - また、ヒトCD45+細胞由来のhCD34+細胞の割合を分析し、長期再増殖細胞を評価した。生着したヒト細胞の多系列再構成を評価するために、以下の表9に従って100μLの細胞懸濁液を染色する。
注:抗体は実験前に滴定する必要があります。 - フローサイトメトリーソフトウェアを使用して、P1細胞集団からhCD45をゲートし、hCD45から、hCD19、hCD3、およびhCD13(リンパ系および骨髄系サブセット)の割合を定量します。
9. 生着骨髄単核球における遺伝子編集頻度の評価
- 骨髄単核球ペレットに、5 x 105細胞用の50 μLのクイック抽出溶液(材料の表を参照)を加え、ペレットを再懸濁します。
- 混合物を68°Cのサーモサイクラーで30分間インキュベートします。短時間スピンした後、混合物をサーモサイクラー中で98°Cで10分間インキュベートします。
- 分光光度計を使用して粗ライセート中のDNA濃度を測定します。手順 4.2.-4.4 に従います。ICE解析8,15を用いて遺伝子編集頻度を検証する。
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Representative Results
本研究では、エクスビボ培養におけるCD34 + CD133 + CD90 + HSCの保持を促進する理想的なHSPC培養条件を特定します。遺伝子改変造血幹細胞の増強とともに造血幹細胞の培養濃縮を実証するために、PBMNC単離、CD34+細胞精製、培養、遺伝子編集、移植、生着の特性評価、およびin vivoでの遺伝子改変細胞のための最適化された手順が提供されています(図1)。精製後、HSPCマーカーを確認するためにフローサイトメトリー評価を行い、HSPCを72時間培養した。培養72時間後、HSPCをCas9 RNPで核形成し、さらに2日間培養した。RUSカクテルを含む最適化された培養条件は、CD34+CD133+CD90+ HSCの生存率の増加と頻度の増加、および遺伝子編集頻度の増加を示しました(図2)。最適化された培養条件がin vivoでの遺伝子改変細胞の頻度を増加させることをさらに実証するために、CCR5遺伝子座を標的とする3日目のHSPCを遺伝子編集し、致死下に照射されたNSGマウスに注入した。マウス骨髄(BM)におけるヒト細胞の生着を注入後16週間で分析した(図3A)。NSGマウスのヒトCD45+(hCD45)細胞のフローサイトメトリー分析では、培養条件での生着の増加が示されました(図3B、C)。マウスBM細胞における遺伝子編集頻度の分析は、RUS添加培養条件における遺伝子編集HSPCの生着の増加を示した(図3D)。
図1:本研究のまとめ。 PBMNCの単離、PBMNCからのCD34+ 細胞の磁気濃縮、培養、ヒト造血幹および前駆細胞(HSPC)の特性評価、遺伝子編集、および移植に関与する手順のグラフ要約が表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:RUSカクテルはHSCの頻度を高めます。mPB-HSPCを、ビヒクル(DMSO)およびRUSカクテルを含むサイトカインを含む幹細胞培養培地で3日間培養し、25 pMのCas9-RNPで遺伝子編集しました。遺伝子編集された細胞を、核分裂後48時間でHSPCのマーカーについてFACSによって分析した。(A)フロープロットは、生細胞(7AAD−)およびCD34+ CD90+集団を表す。(B)DMSOおよびRUS処理群における編集後72時間で分析されたインデルパターンの割合と頻度。(C)編集後48時間で分析したCD34+ CD90+細胞の絶対数(n = 2)(ドナー= 1)。(d)編集後48時間(n=2)で解析した全有核細胞(TNC)の絶対数(ドナー=1)。エラーバーはSEM±平均を表し、*p ≤ 0.05(対応のないt検定)を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:最適化された培養条件は、 in vivoでの遺伝子改変細胞の頻度を増加させる 。 (a)実験の模式図。(B)マウスBMにおけるhCD45+ 細胞を示す代表的なFACSプロット。挿入図は、ヒト細胞(左)とマウス細胞(右)を指します。HSPCを3日間培養し、3日目にsgRNAで遺伝子編集し、エレクトロポレーション後すぐに移植しました。(C)注入後16週でのマウスBMにおけるヒト細胞の生着(n = 4)。(d)ヒト遺伝子改変細胞(hCD45+ 遺伝子編集細胞)注入後16週目におけるマウスBMにおけるキメラ(n=4)(ドナー=1)。各ドットは個々のマウスを表し、データポイントは個々の実験からのものです。エラーバーはSEM±平均を表し、*p≤0.05(対応のないt検定)を表します。この図は、Christopher et al.7の許可を得て適応されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 細胞数 | 精製バッファー(mL) |
| < 1 x 107 セル | 0.1 |
| 1 x 107 - 1 x 108 セル | 0.5 |
| 1 - 5 x 108 セル | 1 |
表1:CD34+ 細胞精製用の細胞懸濁液を調製するための精製バッファーの容量。
| プライマー名 | 順序 |
| CCR5 フォワード | CAGAGCCAAGCTCTCCATC |
| CCR5リバース | アガガクカ |
| CCR5シーケンシングフォワードプライマー | AATGTAGACATCTATGTAGG |
表2:CCR5遺伝子座を増幅するためのプライマー配列。
| コンポーネント | 50 μL 反応 |
| バッファ (5x) | 10 μL |
| フォワードプライマー (10 μM) | 1 μL |
| リバースプライマー (10 μM) | 1 μL |
| dNTP | 4 μL |
| ポリメラーゼ | 1 μL |
| ゲノムDNA | 200 ng |
| ヌクレアーゼフリー水 | 最大 50 μL |
表3:PCRを用いてCCR5遺伝子座を増幅するための反応混合物。
| ステップス | 期間 | 温度 | サイクル数 |
| 初期変性 | 1 ミン | 95 °C | 1 |
| 変性 | 10秒 | 98 °C | 35 |
| アニーリング | 15秒 | 56 °C | |
| 延長 | 30秒 | 68 °C | |
| 最終延長 | 1 ミン | 72 °C | 1 |
| 持つ | ∞ | 15 °C |
表4:CCR5遺伝子座を増幅するためのサーモサイクラー条件。
| コンポーネント | 10 μL 反応 |
| バッファ (5x) | 2 μL |
| プライマー (2 μM) | 1.6 μL |
| RR ミックス | 0.75 μL |
| PCRクリーンアップ製品 | 80 ng |
| ヌクレアーゼフリー水 | 10 μLまで |
表5:サンガーシーケンシングPCRのための反応混合物。
| ステップス | 期間 | 温度 | サイクル数 |
| 変性 | 15秒 | 96 °C | 27 |
| アニーリング | 20秒 | 55 °C | |
| 延長 | 4 ミン | 60 °C | |
| 持つ | ∞ | 15 °C |
表6:サンガーシーケンシングPCRのサーモサイクラー条件。
| バッファ | 組成 |
| 10x RBC 溶解バッファー – 100 mL (pH – 7.3) | 8.26 g の NH4Cl, 1.19 g の NaHCO3, 200 μL の EDTA (0.5 M, pH8) |
| 50x TAE バッファー (pH – 8.3) | 50 mM EDTAナトリウム塩、2 Mトリス、1 M氷酢酸を1 Lの水に溶解 |
表7:バッファー組成
| 抗体 | 容積 |
| 抗ヒトCD45 APC | 3 μL |
| 抗マウスCD45.1 PerCP-Cy5 | 4.5 μL |
| アンチマウスCD34 PE | 3 μL |
表8:ヒト細胞の生着を評価するために使用した抗体。
| 抗体 | 容積 |
| 抗ヒトCD45 APC | 3 μL |
| 抗マウスCD19 PerCP | 15 μL |
| 抗マウスCD13 PE | 15 μL |
| 抗マウスCD3 PE-Cy7 | 2 μL |
表9:生着したHSPCに由来する多系列細胞の割合を評価するために使用した抗体。
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Discussion
HSPC遺伝子治療の成功は、主に移植片中の生着可能な造血幹細胞の質と量に依存しています。ただし、HSCの機能特性は、遺伝子操作手順に関連するin vitro培養や毒性など、遺伝子治療製品の準備段階で大きな影響を受けます。これらの制限を克服するために、エクスビボ培養でCD34 + CD133 + CD90 + HSCのステム性を保持する理想的なHSPC培養条件を特定しました。多くの研究グループは、SR1またはUM171または他の分子をスタンドアロン分子として使用して、in vitroで臍帯血(UCB)HSPCを拡張しています23,24。以前の研究では、SR1とUM171の両方の組み合わせを使用していました25。培地の低分子およびサイトカインは、動員された成人HSPCおよび自家遺伝子治療におけるそれらの応用のために特別に最適化されました。スクリーニング実験により、レスベラトロール、UM729、SR1の3つの低分子を組み合わせることが、多数のCD34+CD90+細胞を生成し、分化およびコミットされた前駆細胞の増殖を抑制するために重要であることが示されました。RUSカクテルのUM729はUM171に置き換えることができます。ただし、UM171の商業調達はあまり実現可能ではありません。サイトカイン濃度は、スケールアッププロセス中の変動を減少させるために臨床試験26で採用されたプロトコルから採用される。サイトカインカクテルには、IL3の代わりにIL6が含まれており、in vitroでの前駆体増殖とHSC枯渇を最小限に抑えます27。培養培地(基礎培地+ RUS +サイトカインカクテル)の新鮮なアリコートを調製することは、実験の変動を減らし、高い再現性を得るために推奨されます。このプロトコルは、NHEJおよびHDRを介した遺伝子編集の両方に適用できます。特に、エレクトロポレーション前48〜72時間およびエレクトロポレーション後24時間のHSPC培養は、HDR遺伝子編集に不可欠です。最適化された培養条件は、幹細胞を保存することにより、HDR遺伝子編集に役立つはずです。また、培養条件が長期造血幹細胞におけるレンチウイルス形質導入を補助することも観察された。このことから、AAV6やIDLVなどのウイルス粒子をHDRドナーとして用いた場合、最適化された培養条件が造血幹細胞へのドナー送達を促進するため、HDR編集効率が向上することが期待されます。
NHEJおよびHDRなどの遺伝子編集結果を評価するには、NGS分析、プローブまたはddPCR分析、またはサンガーシーケンシング7、8、28が提案され、その後、その堅牢な定量的性質により、オンラインツール(ICE/ICEノックイン)16を使用してデコンボリューションが推奨されます。あるいは、編集されたDNAサンプルに対してT7エンドヌクレアーゼアッセイを実行し、断片化されたDNAバンドをImageJを使用して定量化することもできます。ただし、T7エンドヌクレアーゼアッセイアプローチは、デコンボリューション分析よりも精度が低く、次世代シーケンシングを対象としています。
移植プロトコルは、NBSGWマウスをブスルファンでコンディショニングすることによっても最適化され、HSPCの生着と再増殖を評価するための低細胞用量を可能にします。全体として、この手順は、遺伝子操作に必要なHSPCの用量を減らし、発展途上国におけるHSPC遺伝子治療の利用可能性を高める必要があります。
本研究では、PBMNC単離、CD34+ HSPC精製、遺伝子編集と検証、およびマウス骨髄に生着した遺伝子編集HSPCの評価のためのプロトコルが実証されました。また、最適化されたHSPC培養がCD34+CD133+CD90+ HSPCを濃縮し、in vivoで遺伝子編集細胞のキメラ性を増加させることも証明されています。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益は存在しないと宣言している。
Acknowledgments
著者らは、CSCRのフローサイトメトリー施設および動物施設のスタッフに感謝したい。A.C.はICMR-SRFフェローシップ、K.V.K.はDST-INSPIREフェローシップ、P.B.はCSIR-JRFフェローシップから資金提供を受けています。 この研究は、インド政府のバイオテクノロジー省によって資金提供されました(助成金番号BT / PR26901 / MED/ 31/377 / 2017およびBT / PR31616 / MED/ 31/408/2019)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4D-Nucleofector® X Unit | LONZA BIOSCIENCE | AAF-1003X | |
| 4D-Nucleofector™ X Kit ( 16-well Nucleocuvette™ Strips) | LONZA BIOSCIENCE | V4XP-3032 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | THERMO SCIENTIFIC | 15240096 | |
| Anti-human CD45 APC | BD BIOSCIENCE | 555485 | |
| Anti-human CD13 PE | BD BIOSCIENCE | 555394 | |
| Anti-human CD19 PerCP | BD BIOSCIENCE | 340421 | |
| Anti-human CD3 PE-Cy7 | BD BIOSCIENCE | 557749 | |
| Anti-human CD90 APC | BD BIOSCIENCE | 561971 | |
| Anti-human CD133/1 | Miltenyibiotec | 130-113-673 | |
| Anti-human CD34 PE | BD BIOSCIENCE | 348057 | |
| Anti-mouse CD45.1 PerCP-Cy5 | BD BIOSCIENCE | 560580 | |
| Blood Irradator-2000 | BRIT (Department of Biotechnology, India) | BI 2000 | |
| Cell culture dish (delta surface-treated 6-well plates) | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 140675 | |
| CrysoStor CS10 | BioLife solutions | #07952 | |
| Busulfan | CELON LABS (60mg/10mL) | - | |
| Guide-it Recombinant Cas9 | TAKARA BIO | 632640 | |
| Cas9-eGFP | SIGMA | C120040 | |
| Centrifuge tube-15ml | CORNING | 430790 | |
| Centrifuge tube-50ml | NUNC (THERMO SCIENTIFIC) | 339652 | |
| DMSO | MPBIO | 219605590 | |
| DNAase | STEMCELL TECHNOLOGIES | 6469 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline- 1X | HYCLONE | SH30028.02 | |
| EasySep™ Human CD34 Positive Selection Kit II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 17856 | |
| EasySep magnet | STEMCELL TECHNOLOGIES | 18000 | |
| Electrophoresis unit | ORANGE INDIA | HDS0036 | |
| FBS | THERMO SCIENTIFIC | 10270106 | |
| Flow cytometer – ARIA III | BD BIOSCIENCE | - | |
| FlowJo | BD BIOSCIENCE | - | |
| Flt3-L | PEPROTECH | 300-19-1000 | |
| Gel imaging system | CELL BIOSCIENCES | 11630453 | |
| HighPrep DTR reagent | MAGBIOGENOMICS | DT-70005 | |
| Human BD Fc Block | BD BIOSCIENCE | 553141 | |
| IL6 | PEPROTECH | 200-06-50 | |
| IMDM media | THERMO SCIENTIFIC | 12440053 | |
| Infrared lamp | MURPHY | - | |
| Insulin syringe 6mm 31G | BD BIOSCIENCE | 324903 | |
| Ketamine | KETMIN 50 | - | |
| Loading dye 6X | TAKARA BIO | 9156 | |
| Lymphoprep | STEMCELL TECHNOLOGIES | 7851 | |
| Mice Restrainer | AVANTOR | TV-150 | |
| Nano drop spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | ND-2000C | |
| Neubauer cell counting chamber | ROHEM INSTRUMENTS | CC-3073 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:005557 | |
| NOD,B6.SCID Il2rγ−/−KitW41/W41 (NBSGW) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:026622 | |
| Nunc delta 6-well plate | THERMO SCIENTIFIC | 140675 | |
| Polystyrene round-bottom tube | BD | 352008 | |
| P3 primary cell Nucleofection solution | LONZA BIOSCIENCE | PBP3-02250 | |
| Pasteur pipette | FISHER SCIENTIFIC | 13-678-20A | |
| PCR clean-up kit | TAKARA BIO | 740609.25 | |
| Mouse Pie Cage | FISCHER SCIENTIFIC | 50-195-5140 | |
| polystyrene round-bottom tube (12 x 75 mm) | STEMCELL TECHNOLOGIES | 38007 | |
| Primer3 | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://primer3.ut.ee/ | |
| QuickExtract™ DNA Extraction Solution | Lucigen | QE09050 | |
| Reserveratrol | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72862 | |
| SCF | PEPROTECH | 300-07-1000 | |
| SFEM-II | STEMCELL TECHNOLOGIES | 9655 | |
| sgRNA | SYNTHEGO | - | |
| SPINWIN | TARSON | 1020 | |
| StemReginin 1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72342 | |
| ICE analysis tool | SYNTHEGO | https://ice.synthego.com/ | |
| Tris-EDTA buffer solution (TE) 1X | SYNTHEGO | Supplied with gRNA | |
| Thermocycler | APPLIED BIOSYSTEMS | 4375305 | |
| TPO | PEPROTECH | 300-18-1000 | |
| Trypan blue | HIMEDIA LABS | TCL046 | |
| UM171 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72914 | |
| UM729 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 72332 | |
| Xylazine | XYLAXIN - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED | - |
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