Essai de transcytose cellulaire endothéliale comme modèle in vitro pour évaluer la perméabilité interne de la barrière hémato-rétinienne

Summary

Ce protocole illustre un test in vitro de transcytose des cellules endothéliales comme modèle pour évaluer la perméabilité interne de la barrière hémato-rétinienne en mesurant la capacité des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines à transporter la peroxydase de raifort à travers les cellules dans les processus de transport transcellulaire médiés par les cavéoles.

Abstract

Le dysfonctionnement de la barrière hémato-rétinienne (BRB) contribue à la physiopathologie de plusieurs maladies oculaires vasculaires, entraînant souvent un œdème rétinien et une perte de vision subséquente. La barrière interne hémato-rétinienne (BRB) est principalement composée d’endothélium vasculaire rétinien à faible perméabilité dans des conditions physiologiques. Cette caractéristique de faible perméabilité est étroitement régulée et maintenue par de faibles taux de transport paracellulaire entre les cellules endothéliales microvasculaires de la rétine adjacentes, ainsi que par le transport transcellulaire (transcytose) à travers elles. L’évaluation de la perméabilité de la barrière transcellulaire rétinienne peut fournir des informations fondamentales sur l’intégrité de l’IBB dans la santé et la maladie. Dans cette étude, nous décrivons un test de transcytose sur cellules endothéliales (CE), comme un modèle in vitro pour évaluer la perméabilité iBRB, en utilisant des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines (HRMEC). Ce test évalue la capacité des HRMECs à transporter la transferrine et la peroxydase de raifort (HRP) dans les processus de transport transcellulaire médiés par les récepteurs et les cavéoles, respectivement. Des HRMECs entièrement confluents cultivés sur membrane poreuse ont été incubés avec de la transferrine marquée par fluorescence (transcytose dépendante de la clathrine) ou HRP (transcytose médiée par les cavéoles) pour mesurer les niveaux de transferrine ou HRP transférés dans la chambre inférieure, indiquant les niveaux de transcytose à travers la monocouche EC. La signalisation Wnt, une voie connue régulant l’iBRB, a été modulée pour démontrer la méthode de dosage de transcytose basée sur HRP médiée par les cavéoles. Le test de transcytose EC décrit ici peut fournir un outil utile pour étudier les régulateurs moléculaires de la perméabilité EC et de l’intégrité iBRB dans les pathologies vasculaires et pour le dépistage des systèmes d’administration de médicaments.

Introduction

La rétine humaine est l’un des tissus les plus exigeants en énergie du corps. Le bon fonctionnement de la rétine neurale nécessite un apport efficace d’oxygène et de nutriments ainsi qu’un flux restreint d’autres molécules potentiellement nocives pour protéger l’environnement rétinien, qui est médié par la barrière hémato-rétinienne (BRB)¹. Semblable à la barrière hémato-encéphalique (BHE) dans le système nerveux central, le BRB agit comme une barrière sélective dans l’œil, régulant le mouvement des ions, de l’eau, des acides aminés et du sucre dans et hors de la rétine. Le BRB maintient également l’homéostasie rétinienne et son privilège immunitaire en empêchant l’exposition à des facteurs circulatoires tels que les cellules immunitaires, les anticorps et les agents pathogènes nocifs². Le dysfonctionnement des BRB contribue à la physiopathologie de plusieurs maladies oculaires vasculaires, telles que la rétinopathie diabétique, la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), la rétinopathie du prématuré (RDP), l’occlusion veineuse rétinienne et l’uvéite, entraînant un œdème vasogénique et une perte de vision subséquente ^3,4,5.

Le BRB se compose de deux barrières distinctes pour deux réseaux vasculaires oculaires distincts, respectivement: le système vasculaire rétinien et le choriocapillaire fenêtré sous la rétine. Le BRB interne (iBRB) est principalement composé de cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes (CMRM) qui tapissent le système microvasculaire rétinien, qui nourrit les couches neuronales rétiniennes internes. D’autre part, l’épithélium pigmentaire rétinien forme le composant majeur du BRB externe, qui se situe entre la rétine neurosensorielle et la choriocapillaris². Pour l’IBRi, le transport moléculaire à travers les CEMR s’effectue par les voies paracellulaires et transcellulaires (Figure 1). Le degré élevé de sélectivité de la substance à travers le BRB repose sur (i) la présence de complexes protéiques jonctionnels qui restreignent le transport paracellulaire entre les cellules endothéliales adjacentes (CE), et (ii) les faibles niveaux d’expression des médiateurs, transporteurs et récepteurs des cavéoles dans les cellules endothéliales qui maintiennent de faibles taux de transport transcellulaire 1,6,7,8 . Les complexes jonctionnels régulant le flux paracellulaire sont composés de jonctions serrées (claudines, occludines), de jonctions adhérentes (cadhérines VE) et de jonctions lacunaires (connexines), permettant le passage de l’eau et de petits composés solubles dans l’eau. Alors que les petites molécules lipophiles diffusent passivement à l’intérieur des CMRM, le mouvement des molécules lipophiles et hydrophiles plus grosses est régulé par les voies trans-endothéliales induites par l’ATP, y compris le transport vésiculaire et les transporteurs membranaires ^5,9.

La transcytose vésiculeuse peut être classée comme une transcytose cavéolaire médiée par la cavéoline, une transcytose dépendante de la clathrine (et médiée par les récepteurs) et une macropinocytose indépendante de la clathrine (Figure 2). Ces processus de transport vésiculeux impliquent des vésicules de tailles différentes, les macropinosomes étant les plus grands (allant de 200 à 500 nm) et les cavéoles les plus petits (en moyenne 50 à 100 nm), tandis que les vésicules recouvertes de clathrine vont de 70 à 150 nm¹⁰. Les caveolae sont des invaginations de membrane plasmique riche en lipides en forme de flacon avec une enveloppe protéique, principalement composée de cavéoline-1 qui lie le cholestérol de la membrane lipidique et d’autres protéines structurelles et de signalisation via leur domaine d’échafaudage^{cavéoline 11}. Les cavéolines travaillent avec la cavine attachée par voie périphérique pour favoriser la stabilisation des cavéoles au niveau de la membrane plasmique¹². Les membranes caveolaires peuvent également transporter des récepteurs pour d’autres molécules telles que l’insuline, l’albumine et les lipoprotéines circulantes, y compris les lipoprotéines de haute densité (HDL) et les lipoprotéines de basse densité (LDL) pour faciliter leur mouvement à travers les cellules endothéliales¹³. Au cours du développement, la formation de BRB fonctionnelle dépend de la suppression de la transcytose EC⁸. L’endothélium rétinien mature présente donc des niveaux relativement faibles de récepteurs cavéoles, cavéoline-1 et albumine par rapport aux autres cellules endothéliales dans des conditions physiologiques, contribuant à ses propriétés de barrière ^4,9.

Parce que la dégradation de l’iBRB est une caractéristique majeure de nombreuses affections oculaires pathologiques, il est essentiel de développer des méthodes pour évaluer la perméabilité vasculaire rétinienne in vivo et in vitro. Ces méthodes aident à fournir des informations probables sur les mécanismes de l’intégrité compromise des BRB et à évaluer l’efficacité des cibles thérapeutiques potentielles. Les essais actuels d’imagerie in vivo ou de fuite vasculaire quantitative utilisent généralement des tests fluorescents (fluorescéine de sodium et dextran), colorimétriques (colorant bleu Evans et substrat de peroxydase de raifort [HRP]) ou radioactifs¹⁴ pour détecter l’extravasation du système vasculaire dans les tissus rétiniens environnants avec l’imagerie au microscope ou dans un lysat tissulaire isolé. Un traceur idéal pour quantifier l’intégrité vasculaire devrait être inerte et suffisamment grand pour pénétrer librement les vaisseaux compromis tout en étant confiné dans des capillaires sains et intacts. Les méthodes employant la fluorescéine de sodium ou le dextran conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC-dextran) dans l’angiographie à la fluorescéine vivante du fond d’œil (FFA) ou sur des supports plats rétiniens isolés sont largement utilisées pour quantifier l’extravasation rétinienne in vivo ou ex vivo. FITC-dextran a l’avantage d’être disponible en différents poids moléculaires allant de 4 à 70 kDa pour les études sélectives^{par taille 15,16,17}. La FITC-albumine (~68 kDa) est un traceur protéique alternatif de grande taille présentant une importance biologique pour les études de fuite vasculaire¹⁸. Le colorant Evans Blue, injecté par voie intracardiale19, rétro-orbitale ou par la veine de la queue 20, repose également sur sa liaison avec l’albumine endogène pour former une grosse molécule qui peut être quantifiée par détection spectrophotométrique ou, moins fréquemment, par microscopie à fluorescence dans des supports plats^20,21. Cependant, ces méthodologies d’imagerie quantitative ou lumineuse ne distinguent souvent pas le transport paracellulaire du transport transendothélial. Pour l’analyse spécifique de la transcytose avec visualisation ultrastructurale des vésicules transcytosées, les molécules traceurs telles que HRP sont généralement utilisées pour localiser les vésicules transcytosées dans les cellules endothéliales qui peuvent être observées au microscope électronique^22,23,24 (Figure 3A-C).

Le développement et l’utilisation de modèles in vitro iBRB pour évaluer la perméabilité des cellules endothéliales pourraient fournir une évaluation robuste et à haut débit pour compléter les expériences in vivo et aider à l’étude des régulateurs moléculaires des fuites vasculaires. Les essais couramment utilisés pour évaluer le transport paracellulaire et l’intégrité des jonctions serrées comprennent la résistance électrique transendothéliale (TEER), une mesure de la conductance ionique (Figure 4)^2,25, et le test de fuite vasculaire in vitro utilisant des traceurs fluorescents de faible poids moléculaire ²⁶. De plus, des tests de modélisation de la transcytose à base de transferrine ont été utilisés pour explorer la transcytose dépendante de la clathrine27. Malgré cela, les tests pour évaluer la BRB et, plus spécifiquement, la transcytose cavéolaire EC rétinienne in vitro sont limités.

Dans cette étude, nous décrivons un test de transcytose EC utilisant des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines (HRMEC) comme modèle in vitro pour déterminer la perméabilité iBRB et la transcytose EC. Ce test repose sur la capacité des HRMECs à transporter la transferrine ou le HRP via les voies de transcytose médiée par les récepteurs ou dépendantes des cavéoles, respectivement (Figure 2). Les HRMECs cultivés à pleine confluence dans la chambre apicale (c.-à-d. insert de filtre) ont été incubés avec de la transferrine conjuguée fluorescente (Cy3-Tf) ou HRP pour mesurer l’intensité de fluorescence correspondant aux niveaux de transferrine ou HRP transférés à la chambre inférieure par transcytose EC uniquement. La confluence de la monocouche cellulaire peut être confirmée en mesurant TEER, indiquant l’intégrité de la jonction serrée²⁵. Pour démontrer la technique TEER et de dosage de la transcytose, des modulateurs moléculaires connus de la perméabilité vasculaire et de la transcytose EC ont été utilisés, notamment le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF)²⁸ et ceux de la signalisation Wnt (ligands Wnt : Wnt3a et Norrin)²⁹.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Boston Children’s Hospital pour la génération d’images de microscopie optique et EM (Figure 3). Les protocoles pour les études in vivo peuvent être obtenus auprès de Wang et al.24. Toutes les expériences impliquant des cellules endothéliales microvasculaires microvasculaires rétiniennes humaines (HRMEC) ont été approuvées…

Representative Results

Les images EM de l’endothélium vasculaire rétinien montrent le transport vésiculaire transcytotique et les vésicules cavéolaires dans les cellules endothéliales in vivo.La transcytose EC peut être visualisée in vivo dans des coupes transversales rétiniennes avec un précipité brun foncé reflétant des vaisseaux sanguins contenant HRP au microscope optique (Figure 3A) et sous forme de précipité dense en électrons indiquant des vésicu…

Discussion

Le BRB joue un rôle essentiel dans la santé et la maladie de la rétine. Les techniques in vitro évaluant la perméabilité vasculaire se sont avérées être des outils cruciaux dans les études concernant le développement et la fonction des barrières (BRB/BBB). La procédure décrite ici pourrait être utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la transcytose EC ou évaluer les modulateurs moléculaires connexes affectant la perméabilité BRB. In vitro Les tests de tra…

Materials

Biological Safety Cabinet	Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific	1286
Cell culture petridish	Nest Biotechnology	704001
Centrifuge	Eppendorf	5702
Centrifuge tubes (15 mL)	Corning Inc.	352097
Centrifuge tubes (50 mL)	Denville Scientific Inc.	C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin	Jackson ImmunoResearch	AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)	Lonza Bioscience	CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements	Lonza Bioscience	CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)	Millipore	MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS)	Lonza Bioscience	CC-4102B
Gelatin	Sigma-Aldrich	G7765
Hemocytometer (2-chip)	Bulldog Bio	DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP)	Sigma-Aldrich	P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)	Cell Systems	ACBRI 181
Incubator	Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific	3110
L cells (for Control-conditioned medium)	ATCC	CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)	ATCC	CRL-2647
Light microscope	Leica	DMi1
Multimode Plate Reader	EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)	GIBCO	10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit	Thermo Fisher Scientific	15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin)	R&D Systems	3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)	R&D Systems	293-VE
Syringe filter (0.22 µm)	Millipore	SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert)	Corning Inc.	CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)	GIBCO	25-200-072
Water bath	Precision, Thermo Fisher Scientific	51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor)	Selleckchem	S1180