Summary
Dit protocol laat zien hoe de kleine extracellulaire blaasjes (hUC-MSC-sEV's) van menselijke navelstreng-afgeleide mesenchymale stamcellen kunnen worden geïsoleerd met een eenvoudige benchtop-instelling op laboratoriumschaal. De grootteverdeling, eiwitconcentratie, sEV-markers en morfologie van geïsoleerde hUC-MSC-sEV's worden gekenmerkt door respectievelijk nanodeeltjestrackinganalyse, BCA-eiwittest, western blot en transmissie-elektronenmicroscoop.
Abstract
Het op ultracentrifugatie gebaseerde proces wordt beschouwd als de gebruikelijke methode voor isolatie van kleine extracellulaire blaasjes (sEV's). De opbrengst van deze isolatiemethode is echter relatief lager en deze methoden zijn inefficiënt in het scheiden van sEV-subtypen. Deze studie demonstreert een eenvoudige benchtopfiltratiemethode om van menselijke navelstreng afgeleide MSC kleine extracellulaire blaasjes (hUC-MSC-sEV's) te isoleren, met succes gescheiden door ultrafiltratie van het geconditioneerde medium van hUC-MSCs. De grootteverdeling, eiwitconcentratie, exosomale markers (CD9, CD81, TSG101) en morfologie van de geïsoleerde hUC-MSC-sEV's werden gekarakteriseerd met respectievelijk nanodeeltjestraceringsanalyse, BCA-eiwittest, western blot en transmissie-elektronenmicroscoop. De grootte van de geïsoleerde hUC-MSC-sEV's was 30-200 nm, met een deeltjesconcentratie van 7,75 × 10 10 deeltjes / ml en een eiwitconcentratie van80 μg / ml. Positieve banden voor exosomale markers CD9, CD81 en TSG101 werden waargenomen. Deze studie toonde aan dat hUC-MSC-sEV's met succes werden geïsoleerd uit hUC-MSCs geconditioneerd medium, en karakterisering toonde aan dat het geïsoleerde product voldeed aan de criteria vermeld in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).
Introduction
Volgens MISEV 2018 zijn sEV's niet-replicerende lipide dubbellaagse deeltjes zonder functionele kern, met een grootte van 30-200 nm1. MSC-afgeleide sEV's bevatten belangrijke signaalmoleculen die een belangrijke rol spelen bij weefselregeneratie, zoals microRNA, cytokines of eiwitten. Ze zijn in toenemende mate een "hotspot" voor onderzoek geworden in regeneratieve geneeskunde en celvrije therapie. Veel studies hebben aangetoond dat MSC-afgeleide sEV's net zo effectief zijn als MSC's bij de behandeling van verschillende aandoeningen, zoals immunomodulatie 2,3,4,5, het verbeteren van osteogenese 6, diabetes mellitus7,8 of vasculaire regeneratie 9,10. Naarmate de vroege fase van de proeven vordert, zijn drie belangrijke belangrijke kwesties met betrekking tot de klinische vertaling van MSC's-EV's benadrukt: de opbrengst van de EV's, de zuiverheid van de EV's (vrij van celresten en andere biologische verontreinigingen zoals eiwitten en cytokines) en de integriteit van het fosfolipide dubbellaagse membraan van de EV's na isolatie.
Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om sEV's te isoleren, waarbij gebruik wordt gemaakt van de dichtheid, vorm, grootte en oppervlakte-eiwit van de sEV's11. De twee meest voorkomende methoden in sEV-isolaties zijn op ultracentrifugatie gebaseerde en op ultrafiltratie gebaseerde technieken.
Op ultracentrifugatie gebaseerde methoden worden beschouwd als gouden standaardmethoden in sEV-isolatie. Twee soorten ultracentrifugatietechnieken die meestal worden gebruikt, zijn differentiële ultracentrifugatie en dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie. Ultracentrifugatiemethoden resulteren echter vaak in een lage opbrengst en vereisen dure apparatuur voor ultracentrifuge met hoge snelheid (100.000-200.000 × g)11. Bovendien zijn ultracentrifugatietechnieken alleen inefficiënt in het scheiden van EV-subtypen (sEV's en grote EV's), wat resulteert in een onzuivere sedimentlaag11. Ten slotte kan ultracentrifugatie van dichtheidsgradiënt ook tijdrovend zijn en aanvullende voorzorgsmaatregelen vereisen, zoals toevoeging van sucrosebuffer om de gradiëntschade tijdens versnellings- en vertragingsstappente remmen 12. Daarom leidt ultracentrifugatie meestal tot een relatief lage opbrengst en is het niet in staat om onderscheid te maken tussen verschillende populaties EV's13, wat de toepassing ervan voor grootschalige EV-preparatenbeperkt 11.
De tweede methode van EV-isolatie is via ultrafiltratie, die is gebaseerd op groottefiltratie. Ultrafiltratie is relatief tijd- en kosteneffectief in vergelijking met ultracentrifugatie, omdat het geen dure apparatuur of lange verwerkingstijden met zich meebrengt14. Ultrafiltratie lijkt dus een effectievere isolatietechniek dan beide bovengenoemde ultracentrifugatiemethoden. De geïsoleerde producten kunnen specifieker zijn op basis van poriegroottes en hogere opbrengst15. De extra kracht die tijdens het filtratieproces wordt opgelopen, kan echter leiden tot de vervorming of uitbarsting van de EV's16.
De huidige paper stelde een kosten- en tijdseffectief benchtop-protocol voor het isoleren van MSC-afgeleide sEV's voor downstream-analyse en therapeutische doeleinden. De methode die in dit artikel wordt beschreven, combineerde een eenvoudige filtratiemethode met bench-top centrifugatie om hoogrenderende en kwalitatief goede EV's te isoleren van hUC-MSCs voor downstream-analyse, inclusief deeltjesgrootteanalyse, biomarkertest en elektronenmicroscopische beeldvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt.
1. Menselijke navelstreng mesenchymale stamcellen en cultuur
- Kweek de hUC-MSCs met een zaaidichtheid van 5 × 103/cm2 in DMEM, aangevuld met 8% Human Platelet Lysate en 1% Pen-Strep. Incubeer de cellen bij 37 °C in 5% CO2. Vervang het celkweekmedium om de 3 dagen om een goede celgroei te garanderen.
- Breid de cellen uit tot doorgang 5 in T175-kolven voor sEV-isolatie.
OPMERKING: Er zijn veel kolven nodig om een hoge opbrengst aan sEV's te oogsten (de opbrengst neemt toe met het aantal cellen).
2. Kleine extracellulaire vesikelisolatie van hUC - MSCs
- Vervang het kweekmedium door verse fenolrode vrije DMEM aangevuld met 1% Pen-Strep [Geconditioneerd medium (CM)] wanneer de cultuur 70%-80% confluentie bereikt bij passage 5.
LET OP: Gebruik alleen basale media; vermijd FBS en humaan bloedplaatjeslysaatsupplement om besmetting door externe sEV's te voorkomen. - Centrifugeer na 24 uur de CM bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C om celresten te verwijderen. Verzamel en filter het supernatant door een filter van 0,22 μm om deeltjes groter dan 220 nm te verwijderen.
- Vul de centrifugaalfiltereenheid met 30 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gefilterd door een filter van 0,2 μm. Centrifugeer de centrifugaalfiltereenheid bij 3.500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Vul de gefilterde CM in de centrifugaalfiltereenheid (het maximale volume van elke eenheid is 70 ml). Centrifugeer de CM bij 3.500 × g bij 4 °C.
OPMERKING: De duur van de centrifugatie moet van tijd tot tijd worden gecontroleerd totdat de oplossing het oppervlak van het filter heeft bereikt. - Gooi de oplossing weg in de beker met filtraatoplossing. Omgekeerd centrifugeren van de monsterfilterbeker met concentraatopvangbeker bij 1.000 x g bij 4 °C gedurende 2 minuten.
- Breng het geconcentreerde CM terug naar de centrifugaalfiltereenheid. Voeg 30 ml gefilterd PBS toe aan de centrifugaalfiltereenheid en centrifugeer de eenheid bij 3.500 × g bij 4 °C.
- Gooi de oplossing weg in de beker met filtraatoplossing. Installeer een concentraatopvangbeker op de filterunit en omgekeerd centrifugeren bij 1.000 × g gedurende 2 minuten bij 4 °C om de gezuiverde sEV's te verkrijgen.
- Filtreer de sEV's door een spuitfilter van 0,22 μm.
- Breng de monsters over in nieuwe buizen en bewaar ze bij -80 °C voor verdere analyse.
3. Karakterisering van hUC-MSC-sEV's
- Analyse van het volgen van nanodeeltjes
- Verdun de geïsoleerde hUC-MSC-sEV's in gefilterde PBS tot 20-100 deeltjes/frame.
- Breng 1 ml van het verdunde monster in de NTA-kamer met behulp van 1 ml wegwerpspuiten.
- Stel de meetinstellingen dienovereenkomstig in: stel het cameraniveau in op niveau 14, bepaal de detectiedrempel om zoveel mogelijk deeltjes op te nemen met de beperking dat 10-100 rode kruizen worden geteld, en het aantal blauwe kruisen is beperkt tot vijf.
- Neem voor elke meting vijf video's van 1 minuut op en analyseer ze met behulp van de NanoSight-software met een detectiedrempel van vijf.
- Voer metingen in drievoud uit voor elk monster.
- Western blotting analyse
- Lyseer de hUC-MSC-sEV's met ijskoude radioimmunoprecipitatietest (RIPA) lysisbuffer, incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 200 × g . Verzamel het supernatant.
- Kwantificeer het eiwit met behulp van een Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit. Stel de gelelektroforeseset dienovereenkomstig samen en voer gelelektroforese uit bij 90 V totdat het eiwit het uiteinde van de stapelgel bereikt. Verander de spanning naar 200 V om de eiwitten te scheiden tot het einde van de oplossende gel.
- Voer semidry-overdracht uit om de eiwitten van de gel over te brengen naar een polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan bij 15 V gedurende 1 uur.
- Blokkeer het PVDF-membraan met 3% runderserumalbumine (BSA)/Tris-gebufferde zoutoplossing-0,1% v/v Tween 20 (TBS-T) gedurende 1 uur op een shaker bij kamertemperatuur. Incubeer het PVDF-membraan als volgt met primaire antilichamen: muis anti-CD 9 monoklonaal antilichaam (1:500), muis anti-CD 81 monoklonaal antilichaam (1:500), muis anti-GRP 94 monoklonaal muis anti-TSG 101 monoklonaal antilichaam (1:500) bij 4 °C 's nachts met constant schudden.
- Was de volgende dag het PVDF-membraan 5 x 5 minuten met TBS-T en incubeer verder met een secundair antilichaam: mierikswortelperoxidase-geconjugeerde muis IgG kappa bindend eiwit (m-IgGκ BP-HRP) (1:5.000) gedurende 1 uur met roeren bij kamertemperatuur.
- Nogmaals, was het PVDF-membraan vijf keer met TBS-T en visualiseer het membraan in een charge-coupled (CCD) imager met behulp van een chemiluminescentiedetectiereagens. Analyseer het expressieniveau van de eiwitten met behulp van ImageJ-software. Open eerst het afbeeldingsbestand in ImageJ (Bestand | Open...). Verbeter de kwaliteit van de afbeelding door de helderheid en het contrast aan te passen (Afbeelding | Aanpassen | Helderheid/contrast). Pas de afbeelding aan totdat de vlekken duidelijk zichtbaar zijn, klik op de knop Toepassen en sla de afbeeldingen op in TIFF-indeling (Bestand | Opslaan als | TIFF...).
- Transmissie elektronenmicroscoop
- Verdun een deel van het hUC-MSC-sEV-monster met vier delen gefilterd PBS tot een totaal volume van 10 μL en incubeer gedurende 15 minuten op een met koolstof bekleed koperen rooster.
- Verwijder overtollig monster met een laboratoriumdoekje en laat het 3 minuten aan de lucht drogen.
- Incubeer 10 μL 1% fosfotungstic acid (PTA) oplossing om het monster gedurende 3 minuten te kleuren.
- Verwijder overtollige 1% PTA-oplossing met een laboratoriumdoekje en laat het 3 minuten aan de lucht drogen.
- Gebruik het monster voor beeldvorming van transmissie-elektronenmicroscoop.
OPMERKING: Raadpleeg afbeelding 1 voor de samengevatte schematische experimentstappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 laat zien dat hUC-MSC-sEV's een deeltjesgroottemodus hebben bij 53 nm, terwijl andere significante pieken van deeltjesgrootte 96 en 115 nm waren. De concentratie hUC-MSC-sEV's gemeten door NTA was 7,75 × 1010 deeltjes / ml. De eiwitconcentratie van hUC-MSC-sEV's gemeten met de BCA-test was ongeveer 80 μg/ml.
In western blotting-analyse toonden hUC-MSC-sEV's positieve banden voor exosomale markers CD9, CD81 en TSG101, maar waren negatief voor GRP94 (figuur 3). GRP94 is een endoplasmatische reticulummarker die vaak wordt gebruikt als negatieve marker voor sEV's. De geïsoleerde hUC-MSC-sEV's werden gevisualiseerd onder TEM om hun grootte en morfologie te bepalen. hUC-MSCs-sEV's met een grootte van ~100 nm en vertoonden een cup-achtige dubbellaagse membraanstructuur (figuur 4).
Figuur 1: Werkschema van de isolatie, reiniging en karakterisering van sEV's. Het geconditioneerde medium werd verzameld uit MSC-cultuur en gefilterd door een filter van 0,22 μm om grote deeltjes te verwijderen. Het gefilterde medium werd overgebracht naar een centrifugaalfiltereenheid om de sEV's te concentreren en omgekeerd gecentrifugeerd om de geconcentreerde sEV's te verzamelen. De geconcentreerde sEV's werden vervolgens geresuspendeerd met koude, gefilterde PBS en de stappen werden herhaald met een centrifugaalfiltereenheid voor de wasstappen. Ten slotte werden de sEV's gesteriliseerd door 0,22 μm filtratie voordat ze werden gekarakteriseerd met behulp van nanodeeltjestraceringsanalyse, western blotting-analyse en transmissie-elektronenmicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Nanoparticle Tracking Analysis van geïsoleerde hUC-MSC-sEV's. De hUC-MSC-sEV's waren 100-1.000x verdund met geklaarde PBS en gemeten met Nanosight NS300 uitgerust met een CMOS-camera, een 20x objectieflens, een blauwe lasermodule (488 nm) en NTA-software. De figuur is een weergave van NTA in drievoud. Afkortingen: hUC-MSC-sEV's = van de menselijke navelstreng afgeleide MSC kleine extracellulaire blaasjes; NTA = analyse van het volgen van nanodeeltjes; CMOS = complementaire metaaloxide halfgeleider. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De biomarkerexpressie van hUC-MSC-sEV's . (A) Western blot analyse van CD9 exosomale positieve marker. (B) Western blot analyse van CD81 exosomale positieve marker. (C) Western blot analyse van TSG101 exosomale positieve marker. (D) Western blot analyse van GRP94 negatieve marker. Alle vier de markers werden vergeleken met cellysaatlysaat als controle. Van links naar rechts, Ladder, Cell lysate, hUC-MSC-sEVs (A,B); Ladder, hUC-MSC-sEV's, Cellysaat, hUC-MSC-sEV's, Cellysaat (C); Ladder, Cell lysate, hUC-MSC-sEVs (D). De cellysaatparen zijn afkomstig van twee replicaten en deze afbeeldingen zijn representatieve afbeeldingen van experimenten die in drievoud zijn uitgevoerd. Afkorting: hUC-MSC-sEVs = human umbilical cord-derived MSC small extracellular vesicles. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Morfologie van enkelvoudige hUC-MSC-sEV's onder transmissie-elektronenmicroscopie. De hUC-MSC-sEV's werden geïncubeerd op een met koolstof gecoat koperen rooster en gekleurd met 1% fosfotungstic acid voordat ze onder de transmissie-elektronenmicroscoop werden bekeken. De hUC-MSC-sEV's, met een grootte van ongeveer 100 nm, vertoonden een cup-achtige dubbellaagse membraanstructuur. Schaalbalk = 100 nm. Het beeld is een vertegenwoordiger van drie onafhankelijke opnames. Afkorting: hUC-MSC-sEVs = human umbilical cord-derived MSC small extracellular vesicles. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EV's zijn een van de belangrijke subsets van het secretoom in MSC's die een cruciale rol spelen tijdens normale en pathologische processen. Echter, sEV's, met een groottebereik tussen 30 en 200 nm, zijn het afgelopen decennium gestegen als een potentieel hulpmiddel voor celvrije therapie. Er werden verschillende technieken ontwikkeld om sEV's te isoleren van MSC's. Differentiële ultracentrifugatie, ultrafiltratie, precipitatie op basis van polymeren, immunoaffiniteitsafvang en op microfluïdica gebaseerde precipitatie hebben echter verschillende voor- en nadelen17. Geen van deze isolatietechnieken kan een hoge herstelsnelheid en specificiteit bereiken. Onderzoekers moeten dus de juiste methoden selecteren op basis van hun voorkeuren op basis van een hoog herstelpercentage of een hoge specificiteit.
Voorafgaand aan de isolatie van MSC's sEV's werden de MSC's beoordeeld op positieve oppervlaktemarkers (CD90, CD105, CD73) en negatieve markers (CD34, CD11b, CD19, CD45 en HLA-DR) door flowcytometrie zoals eerder beschreven18. Het technische voordeel van deze studie van sEV's kan een oplossing bieden voor de huidige situatie. Het vereist alleen een basistafelopstelling in het laboratorium om te voorkomen dat hoogwaardige apparatuur wordt gebruikt om sEV's te isoleren. De MSC's werden uitgehongerd met cultuurmedia in het beschreven protocol zonder enig serum toe te voegen. Dit is cruciaal om besmetting van EV's afkomstig van serumsuppletie te voorkomen. Echter, gezien het feit dat serum supplementen zijn onvermijdelijk in sommige gevallen, exosoom-uitgeputte serum supplementen kunnen worden overwogen bij het formuleren van volledige cultuur media. Bovendien kunnen fenolrode media worden gebruikt als vervanging voor standaardcultuurmedia, omdat deze gemeenschappelijke pH-indicator mogelijk problemen kan veroorzaken met colorimetrische metingen15. Het protocol kan worden verbeterd door een pompfilter van 0,22 μm te gebruiken in plaats van een conventioneel spuitfilter tijdens het verwijderen van deeltjes groter dan 220 nm. Er moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen om de opbrengst van de sEV's te verbeteren. Bij de laatste centrifugatie van CM door een centrifugaalfiltereenheid moet langdurige centrifugatie worden vermeden om ervoor te zorgen dat er voldoende volume oplossing is om de sEV's uit het filter te elueren. Als u dit over het hoofd ziet, kan de opbrengst van sEV's die tijdens de omgekeerde centrifugatiestap worden verzameld, worden verminderd.
Dit protocol is beperkt tot de laboratoriumschaal en is als zodanig mogelijk niet geschikt voor grootschalige isolatie in de industrie. Dit komt door de hoge kosten van het eenmalige gebruik van een centrifugaalfiltereenheid, die niet haalbaar is voor grootschalige isolatie, die over het algemeen een volume van maximaal duizenden liters CM omvat. Samenvattend bieden we een eenvoudig filtratieprotocol op tafelschaal voor het isoleren van sEV's die zijn afgeleid van MSC's. Dit protocol is ook geschikt voor het zuiveren van geïsoleerde sEV's voor verdere downstream-analyse. Hoewel dit protocol specifiek is ontworpen voor sEV's die zijn afgeleid van MSC's, kan een deel van het beschreven protocol worden gebruikt om sEV's te isoleren van verschillende bronnen, zoals lichaamsvloeistof, cellijnen of andere vloeibare bronnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
De publicatie van deze video werd ondersteund door My CytoHealth Sdn. Bhd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Jayabalan, N., et al. Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes. Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).
- Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
- Wang, C., et al. Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils. Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).
- Wei, Y., et al. MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia. Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
- Liu, W., et al. MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).
- Li, F. X. Z., et al. The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications. Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).
- Jayabalan, N., et al. Frontiers in Endocrinology. 8, Front Endocrinol. Lausanne. (2017).
- Wei, Y., et al. Biomaterials. 204, Biomaterials. 13-24 (2019).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 133, 70-81 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Kırbaş, O. K., et al. Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- Ev, B., Ms, K. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, San Diego, Calif. 64-74 (2015).
- Tan, K. L., et al. Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells. Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).
