Isolement, caractérisation et application thérapeutique de vésicules extracellulaires à partir de cellules souches mésenchymateuses humaines en culture
Summary
Le présent protocole décrit la centrifugation différentielle pour isoler et caractériser les VE représentatifs (exosomes et microvésicules) provenant de CSM humaines en culture. D’autres applications de ces véhicules électriques sont également expliquées dans cet article.
Abstract
Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nanoparticules membranaires hétérogènes libérées par la plupart des types de cellules, et elles sont de plus en plus reconnues comme des régulateurs physiologiques de l’homéostasie de l’organisme et des indicateurs importants de pathologies; Entre-temps, leur immense potentiel pour établir des traitements thérapeutiques accessibles et contrôlables est en train d’émerger. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) peuvent libérer de grandes quantités de VE en culture, ce qui s’est révélé prometteur pour relancer une régénération tissulaire efficace et faciliter des applications thérapeutiques étendues avec une bonne évolutivité et reproductibilité. Il existe une demande croissante de protocoles simples et efficaces pour la collecte et l’application des CSM-EV. Ici, un protocole détaillé est fourni basé sur la centrifugation différentielle pour isoler et caractériser les VE représentatifs des CSM humains cultivés, des exosomes et des microvésicules pour d’autres applications. L’adaptabilité de cette méthode est démontrée pour une série d’approches en aval, telles que le marquage, la transplantation locale et l’injection systémique. La mise en œuvre de cette procédure permettra de répondre à la nécessité d’une collecte et d’une application simples et fiables des CSM-EV dans la recherche translationnelle.
Introduction
Les cellules souches sont des cellules pluripotentes indifférenciées ayant une capacité d’auto-renouvellement et un potentiel translationnel1. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont facilement isolées, cultivées, dilatées et purifiées en laboratoire, ce qui reste caractéristique des cellules souches après plusieurs passages. Au cours des dernières années, de plus en plus de preuves ont soutenu l’opinion selon laquelle les CSM agissent en mode paracrine à usage thérapeutique 2,3. En particulier, la sécrétion de vésicules extracellulaires (VE) joue un rôle crucial dans la médiation des fonctions biologiques des CSM. En tant que nanoparticules membraneuses hétérogènes libérées par la plupart des types cellulaires, les VE se composent de sous-catégories appelées exosomes (Exos), microvésicules (MV) et même corps apoptotiquesplus grands 4,5. Parmi eux, Exos est l’EV le plus étudié avec une taille de 40-150 nm, qui est d’origine endosomale et activement sécrété dans des conditions physiologiques. Les MV sont formés par excrétion directement à partir de la surface de la membrane plasmique cellulaire d’un diamètre de 100 à 1 000 nm, caractérisés par une expression élevée de phosphatidylsérine et une expression de marqueurs de surface des cellules donneuses6. Les VE contiennent de l’ARN, des protéines et d’autres molécules bioactives, qui ont des fonctions similaires à celles des cellules mères et jouent un rôle important dans la communication cellulaire, la réponse immunitaire et la réparation des lésions tissulaires7. Les CSM-EV ont été largement étudiés en tant qu’outil thérapeutique acellulaire puissant en médecine régénérative8.
L’isolement et la purification des VE dérivés des CSM sont un problème courant dans le domaine de la recherche et de l’application. À l’heure actuelle, l’ultracentrifugationdifférentielle et à gradient de densité 9, le procédé d’ultrafiltration 10, la séparation immunomagnétique 11, le chromatographe d’exclusion moléculaire12 et la puce microfluidique 13 sont des méthodes largement utilisées dans l’isolement et la purification des véhicules électriques. Avec les avantages et les inconvénients de chaque approche, la quantité, la pureté et l’activité des VE collectés ne peuvent pas être satisfaites en même temps14,15. Dans la présente étude, le protocole de centrifugation différentielle d’isolement et de caractérisation des VE à partir de CSM en culture est présenté en détail, ce qui a favorisé une utilisation thérapeutique efficace 16,17,18,19,20. L’adaptabilité de cette méthode à une série d’approches en aval, telles que le marquage fluorescent, la transplantation locale et l’injection systémique, a également été illustrée. La mise en œuvre de cette procédure permettra de répondre à la nécessité d’une collecte et d’une application simples et fiables des CSM-EV dans la recherche translationnelle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les VE émergent pour jouer un rôle important dans diverses activités biologiques, y compris la présentation de l’antigène, le transport du matériel génétique, la modification du microenvironnement cellulaire et autres. En outre, leur large application apporte de nouvelles approches et opportunités pour le diagnostic et le traitement des maladies21. La mise en œuvre des applications thérapeutiques des VE repose sur une isolation et une caractérisation réussies. Cependant, en raison d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32000974, 81930025 et 82170988) et de la Fondation chinoise des sciences postdoctorales (2019M663986 et BX20190380). Nous sommes reconnaissants de l’aide du Centre national de démonstration de l’enseignement expérimental pour la médecine de base (AMFU) et du Laboratoire central d’analyse et d’essais du Centre d’innovation médicale militaire de l’Université médicale de l’armée de l’air.
Materials
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
| Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
| Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
| Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
| Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
| Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
| Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
| Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
| Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
| PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
| Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
| Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
| Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
| Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
| Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
| Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
| UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
| Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
| Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |
References
- Liu, S., et al. The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619 (2020).
- Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair. Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).
- Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity. Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025 (2019).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).
- Lei, L. M., et al. Exosomes and Obesity-Related Insulin Resistance. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 651996 (2021).
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols In Cell Biology. , 22 (2006).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Liu, S., et al. MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus. Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).
- Deng, C. L., et al. Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).
- Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), 13074 (2021).
- Qiu, X., et al. Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis. Cell Proliferation. 53 (8), 12830 (2020).
- He, X., et al. MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing. Stem Cells International. 2019, 7132708 (2019).
- Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (5), 379-399 (2022).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Nielsen, T., et al. Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma. PLoS One. 14 (1), 0210835 (2019).
- Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
- Williams, A. M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).
- Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).
- Nozaki, T., et al. Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).
- Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274 (2019).
- Kumar, A., et al. High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance. Nature Communications. 12 (1), 213 (2021).
