JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Выделение, характеристика и терапевтическое применение внеклеточных везикул из культивируемых мезенхимальных стволовых клеток человека

Published: September 23, 2022
doi:
10.3791/64135
, , , , , , ,
1College of Life Science,Northwest University, 2State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology,Fourth Military Medical University, 3Xi’an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 4School of Basic Medicine,Fourth Military Medical University, 5Department of Orthodontics, School of Stomatology,Fourth Military Medical University

Summary

В настоящем протоколе описывается дифференциальное центрифугирование для выделения и характеристики репрезентативных ВВ (экзосом и микровезикул) из культивируемых МСК человека. Дальнейшее применение этих электромобилей также объясняется в этой статье.

Abstract

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой гетерогенные мембранные наночастицы, высвобождаемые большинством типов клеток, и они все чаще признаются физиологическими регуляторами гомеостаза организма и важными индикаторами патологий; В то же время появляется их огромный потенциал для создания доступных и контролируемых методов лечения заболеваний. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) могут высвобождать большое количество EV в культуре, что обещает ускорить эффективную регенерацию тканей и облегчить обширное терапевтическое применение с хорошей масштабируемостью и воспроизводимостью. Существует растущий спрос на простые и эффективные протоколы для сбора и применения MSC-EV. Здесь представлен подробный протокол, основанный на дифференциальном центрифугировании, для выделения и характеристики репрезентативных EV из культивируемых человеческих МСК, экзосом и микровезикул для дальнейшего применения. Показана адаптивность этого метода для ряда последующих подходов, таких как маркировка, местная трансплантация и системная инъекция. Реализация этой процедуры позволит удовлетворить потребность в простом и надежном сборе и применении MSC-EV в трансляционных исследованиях.

Introduction

Стволовые клетки представляют собой недифференцированные плюрипотентные клетки со способностью к самообновлению и трансляционным потенциалом1. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) легко выделяются, культивируются, расширяются и очищаются в лаборатории, что остается характерным для стволовых клеток после многократного прохождения. В последние годы появляется все больше данных, подтверждающих мнение о том, что МСК действуют в паракринном режиме при терапевтическом использовании 2,3. В частности, секреция внеклеточных везикул (ВВ) играет решающую роль в опосредовании биологических функций МСК. Как гетерогенные мембранные наночастицы, высвобождаемые из большинства типов клеток, EV состоят из подкатегорий, называемых экзосомами (Exos), микровезикулами (MV) и даже более крупными апоптотическими телами 4,5. Среди них наиболее широко изученным ЭВ размером 40-150 нм является Exos, который имеет эндосомальное происхождение и активно секретируется в физиологических условиях. МВ образуются путем осыпания непосредственно с поверхности клеточной плазматической мембраны диаметром 100-1000 нм, которые характеризуются высокой экспрессией фосфатидилсерина и экспрессией поверхностных маркеров донорскихклеток6. EV содержат РНК, белки и другие биологически активные молекулы, которые имеют функции, аналогичные родительским клеткам, и играют важную роль в клеточной коммуникации, иммунном ответе и восстановлении повреждений тканей7. MSC-EV широко исследовались как мощный бесклеточный терапевтический инструмент в регенеративной медицине8.

Выделение и очистка электромобилей, полученных из MSC, является распространенной проблемой в области исследований и применения. В настоящее время дифференциальное ультрацентрифугирование и градиентплотности 9, процессультрафильтрации 10, иммуномагнитная сепарация11, хроматограф 12 молекулярного исключения и микрофлюидный чип13 широко используются при выделении и очистке электромобилей. Учитывая преимущества и недостатки каждого подхода, количество, чистота и активность собранных электромобилей не могут быть удовлетворены одновременно14,15. В настоящем исследовании подробно показан протокол дифференциального центрифугирования выделения и характеристики ЭВ из культивируемых МСК, который поддерживает эффективное терапевтическое использование 16,17,18,19,20. Далее была показана адаптивность этого метода к ряду последующих подходов, таких как флуоресцентная маркировка, местная трансплантация и системная инъекция. Реализация этой процедуры позволит удовлетворить потребность в простом и надежном сборе и применении MSC-EV в трансляционных исследованиях.

Protocol

Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Четвертого военно-медицинского университета и выполнены в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Использовались ?…

Representative Results

MV и Exos из культивируемых UCMSC человека выделяют в соответствии с экспериментальным рабочим процессом (рис. 1). Результаты NTA показывают, что размер экзо из МСК человека колеблется от 40 нм до 335 нм с пиковым размером около 100 нм, а размер MV колеблется от 50 нм до 445 нм с пиковым ра…

Discussion

Электромобили начинают играть важную роль в различных биологических активностях, включая презентацию антигена, транспорт генетического материала, модификацию микроокружения клеток и другие. Кроме того, их широкое применение открывает новые подходы и возможности для диагностики и ле…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (32000974, 81930025 и 82170988) и Китайского фонда постдокторантуры (2019M663986 и BX20190380). Мы благодарны за помощь Национальному экспериментально-учебно-демонстрационному центру фундаментальной медицины (АМФУ) и Аналитической и испытательной центральной лаборатории Военно-медицинского инновационного центра Медицинского университета ВВС.

Materials

10% povidone-iodine (Betadine) Weizhenyuan 10053956954292 Wound disinfection
Calibration solution Particle Metrix 110-0020 Calibrate the NTA instrument
Carprofen Sigma 53716-49-7 Analgesic medicine
Caudal vein imager  KEW Life Science KW-XXY Caudal vein imager
Centrifuge Eppendorf 5418R Centrifugation
Fatal bovine serum Corning 35-081-CV Culture of UCMSCs
Formvar/carbon-coated square mesh PBL Assay Science  24916-25 Transmission electron microscope
Heating pad Zhongke Life Science Z8G5JBMz Post-treatment care of animals
Heparin Solution StemCell 7980 Systemic injection
Isoflurane RWD Life Science R510-22 Animal anesthesia
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) Gibco C12571500BT Culture of UCMSCs
Nanoparticle tracking analyzer Particle Metrix ZetaView PMX120 Nanoparticle tracking analysis
PBS (1x) Meilunbio MA0015 Resuspend EVs
Penicillin/Streptomycin Procell Life Science PB180120 Culture of UCMSCs
Phosphotungstic acid Solarbio 12501-23-4 Transmission electron microscope
Pipette Eppendorf 3120000224
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit Sigma-Aldrich MINI26 Labeling EVs
Skin biopsy punch Acuderm 69038-10-50 Skin defects
Software ZetaView Particle Metrix Version 8.05.14 SP7 
Thermostatic equipment Grant v-0001-0005 Water bath
Transmission electron microscope HITACHI HT7800 Transmission electron microscope
UCMSCs Bai'ao  UKK220201 Commercially UCMSCs
Ultracentrifuge Beckman XPN-100 Centrifugation
Ultrapure filtered water purification system Milli-Q IQ 7000 Preparation of ultrapure water
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, S., et al. The application of MSCs-derived extracellular vesicles in bone disorders: Novel cell-free therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 619 (2020).
  2. Arthur, A., Zannettino, A., Gronthos, S. The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair. Journal of Cellular Physiology. 218 (2), 237-245 (2009).
  3. Zhou, Y., Yamamoto, Y., Xiao, Z., Ochiya, T. The immunomodulatory functions of mesenchymal stromal/stem cells mediated via paracrine activity. Journal of Clinical Medicine. 8 (7), 1025 (2019).
  4. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  5. Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).
  6. Lei, L. M., et al. Exosomes and Obesity-Related Insulin Resistance. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 651996 (2021).
  7. Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
  8. Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
  9. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols In Cell Biology. , 22 (2006).
  10. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
  11. Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
  12. Boing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  13. Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3175-3180 (2017).
  14. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  15. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
  16. Liu, S., et al. MSC Transplantation Improves Osteopenia via Epigenetic Regulation of Notch Signaling in Lupus. Cell Metabolism. 22 (4), 606-618 (2015).
  17. Deng, C. L., et al. Photoreceptor protection by mesenchymal stem cell transplantation identifies exosomal MiR-21 as a therapeutic for retinal degeneration. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 1041-1061 (2021).
  18. Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), 13074 (2021).
  19. Qiu, X., et al. Exosomes released from educated mesenchymal stem cells accelerate cutaneous wound healing via promoting angiogenesis. Cell Proliferation. 53 (8), 12830 (2020).
  20. He, X., et al. MSC-derived exosome promotes M2 polarization and enhances cutaneous wound healing. Stem Cells International. 2019, 7132708 (2019).
  21. Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (5), 379-399 (2022).
  22. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  23. Nielsen, T., et al. Extracellular vesicle-associated procoagulant phospholipid and tissue factor activity in multiple myeloma. PLoS One. 14 (1), 0210835 (2019).
  24. Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
  25. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
  26. Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
  27. Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
  28. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
  29. Williams, A. M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).
  30. Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).
  31. Nozaki, T., et al. Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).
  32. Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274 (2019).
  33. Kumar, A., et al. High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance. Nature Communications. 12 (1), 213 (2021).

Tags

Keywords: Extracellular VesiclesMesenchymal Stem CellsIsolationCharacterizationDifferential CentrifugationCell CultureTherapeutic ApplicationPKH26 DyeParticle Tracking Analysis
check_url/64135?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Xing, S., Zhang, K., Tang, S., Liu, L., Cao, Y., Zheng, C., Sui, B., Jin, Y. Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (187), e64135, doi:10.3791/64135 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image