Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

في المختبر هضم المستحلبات في قطرة واحدة عن طريق تبادل متعدد الأطوار الفرعية لسوائل الجهاز الهضمي المحاكاة

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64158
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Applied Physics, Faculty of Sciences, Campus de Fuentenueva, University of Granada, 2Department of Physical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Campus de Cartuja, University of Granada, 3Department of Software Engineering, School of Computer and Telecommunication Engineering, Campus de Aynadamar, University of Granada

Summary

يسمح توازن فيلم سطح الإسقاط المعلق الذي يتم تنفيذه بتبادل متعدد الأطوار ، يطلق عليه اسم الأخطبوط ، بمحاكاة ظروف الجهاز الهضمي من خلال تبادل الطور الفرعي المتسلسل للمحلول السائب الأصلي مع سوائل الجهاز الهضمي المحاكاة. تتم مراقبة محاكاة الهضم في المختبر عن طريق تسجيل التوتر السطحي للطبقة البينية المهضومة في الموقع.

Abstract

يتم استخدام المستحلبات حاليا لتغليف وتوصيل العناصر الغذائية والأدوية لمعالجة أمراض الجهاز الهضمي المختلفة مثل السمنة وإغناء المغذيات والحساسية الغذائية وأمراض الجهاز الهضمي. تعتمد قدرة المستحلب على توفير الوظيفة المطلوبة ، أي الوصول إلى موقع معين داخل الجهاز الهضمي ، أو تثبيط / تأخير تحلل الدهون ، أو تسهيل الهضم ، في النهاية على قابليته للتدهور الأنزيمي في الجهاز الهضمي. في مستحلبات الزيت في الماء ، تكون قطرات الدهون محاطة بطبقات بينية ، حيث تعمل المستحلبات على تثبيت المستحلب وحماية المركب المغلف. يعتمد تحقيق هضم مخصص للمستحلبات على تركيبتها الأولية ولكنه يتطلب أيضا مراقبة تطور تلك الطبقات البينية لأنها تخضع لمراحل مختلفة من الهضم المعدي المعوي. يسمح توازن فيلم سطح الإسقاط المعلق الذي يتم تنفيذه بتبادل متعدد الأطوار الفرعية بمحاكاة الهضم في المختبر للمستحلبات في قطرة مائية واحدة مغمورة في الزيت من خلال تطبيق نموذج هضم ثابت مخصص. يتم محاكاة العبور عبر الجهاز الهضمي من خلال تبادل الطور الفرعي للمحلول السائب الأصلي للقطرات مع الوسائط الاصطناعية ، مما يحاكي الظروف الفسيولوجية لكل حجرة / خطوة من الجهاز الهضمي. يتم تسجيل التطور الديناميكي للتوتر البيني في الموقع في جميع أنحاء الهضم المعدي المعوي المحاكي بأكمله. يتم قياس الخواص الميكانيكية للواجهات المهضومة ، مثل المرونة التوسعية واللزوجة ، بعد كل مرحلة هضم (عن طريق الفم ، المعدة ، الأمعاء الدقيقة). يمكن ضبط تكوين كل وسائط هضمية لمراعاة خصوصيات أمراض الجهاز الهضمي ، بما في ذلك أمراض الجهاز الهضمي ووسائط الجهاز الهضمي للرضع. يتم تحديد الآليات البينية المحددة التي تؤثر على التحلل البروتيني وتحلل الدهون ، مما يوفر أدوات لتعديل الهضم عن طريق الهندسة البينية للمستحلبات. يمكن التلاعب بالنتائج التي تم الحصول عليها لتصميم مصفوفات طعام جديدة بوظائف مخصصة مثل انخفاض الحساسية ، واستهلاك الطاقة المتحكم فيه ، وانخفاض قابلية الهضم.

Introduction

يعد فهم كيفية هضم الدهون ، والتي تتضمن هضم المستحلب ، أمرا مهما لتصميم المنتجات بعقلانية بوظائف مخصصة1. الركيزة لهضم الدهون هي مستحلب حيث يتم استحلاب الدهون عند الاستهلاك عن طريق العمل الميكانيكي والاختلاط مع المواد الخافضة للتوتر السطحي في الفم والمعدة. أيضا ، فإن معظم الدهون التي يستهلكها البشر مستحلبة بالفعل (مثل منتجات الألبان) ، وفي حالة الرضع أو بعض كبار السن ، هذا هو الشكل الوحيد للاستهلاك. وبالتالي ، فإن تصميم المنتجات القائمة على المستحلب مع ملامح هضم محددة مهم جدا في التغذية1. علاوة على ذلك ، يمكن للمستحلبات تغليف وتقديم العناصر الغذائية أو الأدوية أو المواد الحيوية المحبة للدهون2 لمعالجة حالات الجهاز الهضمي المختلفة مثل السمنة3 ، وإغناء المغذيات ، والحساسية الغذائية ، وأمراض الجهاز الهضمي. في مستحلبات الزيت في الماء ، تحاط قطرات الدهون بطبقات بينية من المستحلبات مثل البروتينات والمواد الخافضة للتوتر السطحي والبوليمرات والجسيمات والمخاليط4. دور المستحلبات ذو شقين: تثبيت المستحلب5 وحماية / نقل المركب المغلف إلى موقع معين. يعتمد تحقيق هضم مخصص للمستحلبات على تكوينها الأولي ولكنه يتطلب أيضا مراقبة التطور المستمر لهذه الواجهة أثناء العبور عبر الجهاز الهضمي (الشكل 1).

Figure 1
الشكل 1: تطبيق الهندسة البينية للمستحلبات لمعالجة بعض حالات الجهاز الهضمي الرئيسية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

هضم الدهون هو في النهاية عملية بينية لأنه يتطلب امتزاز الليباز (المعدة أو البنكرياس) على واجهة الزيت والماء لقطرات الدهون المستحلبة عبر الطبقة البينية للوصول إلى الدهون الثلاثية الموجودة في الزيت وتحللها إلى أحماض دهنية حرة وأحادي الجلسريد6. هذا مخطط في الشكل 2. يتنافس إنزيم الليباز المعدي مع البيبسين والفوسفوليبيدات في المعدة على واجهة الزيت والماء (الشكل 2، الهضم في المعدة). بعد ذلك ، يتنافس الليباز / الكوليباز البنكرياسي مع التربسين / الكيموتريبسين ، والدهون الفوسفاتية ، والأملاح الصفراوية ، والمنتجات الهضمية في الأمعاء الدقيقة. يمكن أن يغير البروتياز التغطية البينية ، ويمنع أو يفضل امتزاز الليباز ، في حين أن الأملاح الصفراوية نشطة للغاية على السطح وتحل محل معظم المستحلب المتبقي لتعزيز امتزاز الليباز (الشكل 2 ، الهضم المعوي). في النهاية ، يعتمد معدل ومدى تحلل الدهون على الخصائص البينية للمستحلب الأولي / المهضوم في المعدة ، مثل السماكة ، والوصلات بين الجزيئات / داخل الجزيئات ، والتفاعلات الكهروستاتيكية والمعقمة. وبناء على ذلك ، فإن مراقبة تطور الطبقة البينية أثناء هضمها توفر منصة تجريبية لتحديد الآليات والأحداث البينية التي تؤثر على امتزاز الليباز ، وبالتالي هضم الدهون.

Figure 2
الشكل 2: شكل تخطيطي يوضح دور السطوح البينية في هضم الليبيدات المعدية المعوية. يغير التحلل المائي للببسين التركيب السطحي في مرحلة المعدة ، بينما يتحلل الليباز المعدي الدهون الثلاثية. في الأمعاء الدقيقة ، يقوم التربسين / الكيموتريبسين بتحلل الفيلم البيني ، بينما يستمر تحلل الدهون عن طريق امتزاز BS / lipases ، والتحلل المائي للدهون الثلاثية ، وامتصاص المنتجات المحللة للدهون عن طريق الذوبان في مذيلات BS / المجمع. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يتم تنفيذ معدات إسقاط القلادة في جامعة غرناطة (UGR) بتقنية حاصلة على براءة اختراع ، وهي الشعيرات الدموية المزدوجة المحورية ، والتي تتيح تبادل الطور الفرعي للحل السائب7. تتكون الشعيرات الدموية ، التي تحمل قطرة القلادة ، من ترتيب من شعريتين متحدتي المحور متصلتين بشكل مستقل بكل قناة من حاقن دقيق مزدوج. يمكن لكل حاقن دقيق أن يعمل بشكل مستقل ، مما يسمح بتبادل المحتوى المتساقط عن طريق التدفق7. وفقا لذلك ، يتكون تبادل الطور الفرعي من الحقن المتزامن للمحلول الجديد مع الشعيرات الدموية الداخلية واستخراج المحلول السائب مع الشعيرات الدموية الخارجية باستخدام نفس معدل التدفق. تسمح هذه العملية باستبدال المحلول السائب دون أي اضطراب في المنطقة البينية أو حجم القطرة. تمت ترقية هذا الإجراء لاحقا إلى تبادل متعدد الأطوار الفرعية ، والذي يسمح بما يصل إلى ثمانية تبادلات متسلسلة للمرحلة الفرعية للمحلول السائبللقطرات 8. يتيح ذلك محاكاة عملية الهضم في قطرة مائية واحدة معلقة في وسط دهني عن طريق تبادل المحلول السائب بالتتابع مع وسائط اصطناعية تحاكي المقصورات المختلفة (الفم والمعدة والأمعاء الدقيقة). يتم تمثيل الإعداد بأكمله في الشكل 3 ، بما في ذلك تفاصيل المكونات. يتم توصيل المحاقن الموجودة في الحاقن الدقيق بالصمامات الثمانية ، كل منها متصل بأنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على السائل الهضمي الاصطناعي مع المكونات الموضحة في الشكل 2.

Figure 3
الشكل 3: منظر عام للأخطبوط مع جميع المكونات. كاميرا CCD ، المجهر ، محدد الموضع الدقيق ، الخلية المستقرة بالحرارة ، والشعيرات الدموية المزدوجة متصلة بشكل مستقل بحاقن دقيق مزدوج مع حقنتين متصلتين بثمانية صمامات vias. تتصل كل حقنة بأنابيب شعرية وأربعة أنابيب طرد مركزي دقيقة مع عينة وتفريغ واحد. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يوضح الشكل 4 أ كيف يتم حقن كل من موائل الهضم الاصطناعي في قطرة القلادة عن طريق تبادل الطور الفرعي عبر الشعيرات الدموية المزدوجة. يمكن تطبيق كل مركب هضمي مفصل في الشكل 2 في وقت واحد / بالتتابع ، لمحاكاة المرور عبر الجهاز الهضمي. تحتوي السوائل الهضمية الاصطناعية على إنزيمات مختلفة ومواد خافضة للتوتر السطحي الحيوي ، والتي تغير التوتر البيني للمستحلب الأولي ، كما هو مخطط في الشكل 4 ب. يسجل برنامج DINATEN (انظر جدول المواد) ، الذي تم تطويره أيضا في UGR ، تطور التوتر البيني في الوقت الفعلي حيث يتم هضم الطبقة البينية الأولية في المختبر. أيضا ، بعد كل مرحلة هضمية ، يتم حساب المرونة التوسعية للطبقة البينية عن طريق فرض تذبذبات دورية للحجم / المنطقة البينية على الطبقة البينية المستقرة وتسجيل استجابة التوتر بين الأنف. يمكن أن تتنوع الفترة / التردد وسعة التذبذب ، وتوفر معالجة الصور باستخدام البرنامج CONTACTO المعلمات الريولوجية التوسعية8.

Figure 4
الشكل 4: أمثلة على ملامح الهضم . (أ) تخضع طبقة المستحلب الأولية لوسائط هضمية اصطناعية موضوعة في جهاز الطرد المركزي الدقيق عن طريق تبادل الطور الفرعي المتسلسل للمحاليل المختلفة في قطرة القلادة. (ب) التطور العام للتوتر البيني (المحور ص) للمستحلب الأولي كدالة للوقت (المحور السيني) حيث يتم هضمه في المختبر بواسطة مختلف الإنزيمات / المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي في الوسائط الاصطناعية. يقيس تبادل المرحلة الفرعية النهائية مع السائل المعوي العادي امتزاز الدهون المهضومة عن طريق الذوبان في المذيلات المختلطة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تقدم هذه الدراسة البروتوكول العام المصمم لقياس الهضم في المختبر للطبقات البينية باستخدام معدات إسقاط القلادة9. تخضع الطبقة البينية الأولية بالتتابع لظروف تحاكي المرور عبر الجهاز الهضمي ، كما هو موضح في الشكل 2. يتم حقن هذه الوسائط الهضمية المختلفة في قطرة القلادة عن طريق تبادل الطور الفرعي للحلول المختلفة الموجودة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (الشكل 4 أ). يمكن تخصيص تركيبة هذه الوسائط اعتمادا على ظروف الجهاز الهضمي التي سيتم تقييمها ، وهي تحلل البروتين المعدي / المعوي / تحلل الدهون ، مما يسمح بقياس الآثار التراكمية و sinergies10. تتبع الظروف التجريبية المستخدمة لمحاكاة عملية الهضم في كل حجرة بروتوكول الإجماع الدولي الذي نشرته INFOGEST الذي يوضح بالتفصيل درجة الحموضة وكميات الشوارد والإنزيمات11. يسمح الجهاز التجريبي القائم على قطرة القلادة بتسجيل التوتر البيني في الموقع طوال عملية الهضم المحاكاة. يتم حساب الريولوجيا التوسعية للطبقة البينية في نهاية كل خطوة هضمية. بهذه الطريقة ، يقدم كل مستحلب ملف تعريف هضم يوضح خصائص الواجهات المهضومة ، كما هو موضح في الشكل 4 ب. هذا يسمح باستخراج الاستنتاجات المتعلقة بقابليتها أو مقاومتها للمراحل المختلفة من عملية الهضم. بشكل عام ، تحتوي الوسائط الهضمية الاصطناعية على حمض / درجة الحموضة الأساسية ، والكهارل ، والبروتياز (المعدة والأمعاء) ، والليباز (المعدة والأمعاء) ، والأملاح الصفراوية ، والدهون الفوسفاتية ، والتي تذوب في سوائل الجهاز الهضمي الخاصة بها (المعدة أو الأمعاء). يوضح الشكل 4B صورة عامة لتطور التوتر البيني للمستحلب ، الذي تعرض أولا لعمل البروتياز ، يليه الليباز. بشكل عام ، يعزز التحلل البروتيني للطبقة البينية زيادة التوتر البيني بسبب امتزاز الببتيدات المتحللة 9,12 ، بينما يؤدي تحلل الدهون إلى انخفاض حاد جدا في التوتر البيني بسبب امتزاز الأملاح الصفراوية والليباز 13. يستنفد تبادل المرحلة الفرعية النهائي مع السائل المعوي المحلول الأكبر من المواد غير الممتصة / المهضومة ويعزز امتصاص المركبات القابلة للذوبان وإذابة الدهون المهضومة في المذيلات المختلطة. يتم قياس ذلك من خلال زيادة التوتر السطحي المسجل (الشكل 4 ب).

باختصار ، يسمح التصميم التجريبي الذي تم تنفيذه في قطرة القلادة لمحاكاة الهضم في المختبر في قطرة واحدة بقياس التأثيرات التراكمية والتآزر حيث يتم تطبيق عملية الهضم بالتتابع على الطبقة البينية الأولية10. يمكن ضبط تكوين كل وسائط هضمية بسهولة لمراعاة خصوصيات أمراض الجهاز الهضمي ، بما في ذلك أمراض الجهاز الهضمي أو وسائط الجهاز الهضمي للرضع14. بعد ذلك ، يمكن استخدام تحديد الآليات البينية التي تؤثر على التحلل البروتيني وتحلل الدهون لتعديل الهضم عن طريق الهندسة البينية للمستحلبات. يمكن تطبيق النتائج التي تم الحصول عليها في تصميم مصفوفات غذائية جديدة ذات وظائف مخصصة مثل انخفاض الحساسية ، واستهلاك الطاقة المتحكم فيه ، وانخفاض قابلية الهضم15،16،17،18،19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تسلسل التنظيف لجميع الأواني الزجاجية المستخدمة في تجارب علوم السطح

  1. افرك الأواني الزجاجية بمحلول تنظيف مركز (انظر جدول المواد) مخفف بالماء (10٪).
  2. اشطفه جيدا بسلسلة من ماء الصنبور والبروبانول والماء المقطر والماء عالي النقاء. تجف في المقصورة وتخزينها في خزانة مغلقة حتى الاستخدام.

2. إعداد عينة

  1. تحضير وسائط الجهاز الهضمي الاصطناعية وفقا لبروتوكولات INFOGEST الموحدة11،20 (انظر جدول المواد). لمزيد من التفاصيل ، انظر الجدول 1 وقم بتضمين تعديلات صغيرة لمتطلبات العمل البيني لمنع التلوث النشط للسطح وتخفيف العينات ( 1 :10)10.
  2. قم بإعداد محلول المستحلب باتباع الخطوات أدناه.
    1. تحضير 0.01 لتر من محلول مركز من (1 كجم· L−1) مستحلب أو خليط من المستحلبات (انظر جدول المواد) في مخزن مؤقت أولي (الجدول 1) ويحفظ تحت الإثارة الخفيفة طوال الليل.
    2. تمييع إلى 0.1 كجم· L−1 (أو كما هو مطلوب) لتشبع الواجهة ؛ الوصول إلى هضبة زائفة في التوتر البيني بعد 1 ساعة من الامتزاز في منطقة بينية ثابتة بعد التقريرالمنشور سابقا 21.
    3. يحفظ تحت الهياج الخفيف لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام.
  3. تنقية مرحلة النفط.
    1. تحضير خليط من الزيت النباتي (عباد الشمس ، الزيتون ، تريولين ، إلخ.) وراتنجات ميتاسيليكات المغنيسيوم (انظر جدول المواد) بنسبة 2: 1 وزن / وزن في دورق كبير. يحفظ تحت التحريض الميكانيكي المعتدل لمدة 3 ساعات على الأقل.
    2. جهاز طرد مركزي للخليط على 8000 × جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في جهاز طرد مركزي تجاري (انظر جدول المواد).
    3. قم بتصفية خليط الزيت تحت فراغ باستخدام مرشح حقنة (حجم مسام 0.2 ميكرومتر) (انظر جدول المواد). يخزن في زجاجات كهرمانية نظيفة محكمة الغلق ومغطاة بالنيتروجين حتى الاستخدام.

3. معايرة وتنظيف الأخطبوط

  1. شطف جميع الأنابيب بالماء عالي النقاء عن طريق ضبط سلسلة من تنظيف كل من المحاقن وجميع الصمامات من خلال الشعيرات الدموية (الصمامات 6/4) والمخرج الخارجي (صمام 8-اللون الأزرق). قم بذلك عن طريق الضغط على زر التنظيف في مربع الحوار الأيسر (الشكل التكميلي 1 أ).
  2. تحقق من التوتر السطحي7 من الماء في درجة حرارة الغرفة عن طريق تكوين قطرة ماء والقياس في الوقت الفعلي لمدة 5 دقائق (الشكل التكميلي 1B ، C).
    1. اضبط الكثافة التفاضلية على الهواء والماء (0.9982 كجم · L−1) في مربع الحوار الأيسر، الشكل التكميلي 1B.
  3. املأ الكوفيت النظيف (الزجاج البصري) ب 0.002 لتر من الزيت النباتي النظيف وضعه في حامل الكوفيت في الخلية الثرموستاتية (الشكل 3).
  4. اضبط منظم الحرارة واترك توازن درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية.
  5. تحقق من التوتر السطحي لزيت الماء في درجة حرارة الغرفة7.
    1. اضبط الكثافة التفاضلية على الزيت النباتي والماء (زيت الزيتون: 0.800 كجم · L−1) (الشكل التكميلي 1C).
    2. حقن 40 ميكرولتر بمعدل 0.5 ميكرولتر·s−1 والقياس في الوقت الحقيقي كل ثانية حتى نهاية الحقن. هذه عملية ديناميكية بسيطة (الشكل التكميلي 1B ، D).
    3. ارسم التوتر السطحي كدالة لحجم القطرة في ورقة بيانات.
    4. تحقق من أن نطاق حجم القطرة يوفر قيمة للتوتر السطحي بشكل مستقل عن حجم القطرة. ارسم المنطقة البينية كدالة لحجم القطرات.
    5. برمجة عملية تحتوي على خطوتين (الشكل التكميلي 1B والشكل التكميلي 2A) باتباع الخطوات أدناه.
      1. باستخدام حقنة داخلية ، قم بحقن حجم موجود داخل هذا النطاق من التوتر السطحي المستمر.
      2. حافظ على ثبات المنطقة البينية عند القيمة المحددة في الخطوة 3.5.4 وسجل التوتر البيني لمدة 5 دقائق7.

4. برمجة عملية تجريبية واحدة في ديناتين لكل خطوة هضمية

ملاحظة: للاطلاع على معلمات العملية، انظر الشكل التكميلي 1B.

  1. قم بإجراء التحكم الأولي.
    1. لتشكيل السقوط ، قم بحقن 10 ميكرولتر (±5 ميكرولتر) من محلول المستحلب في الشعيرات الدموية (الصمام 6) (الشكل التكميلي 2 أ).
    2. سجل الامتزاز في منطقة بينية ثابتة 21 من 20 مم 2 (±10 مم2) لمدة 1 ساعة (الشكل التكميلي 2B).
    3. سجل الريولوجيا التوسعية8 (الشكل التكميلي 2C).
      1. اضبط سعة التذبذب على 1.25 ميكرولتر ، الفترة 10 ثوان.
      2. سجل الامتزاز في المنطقة البينية المحددة (الخطوة 4.1.2) لمدة 10 ثوان.
      3. كرر الخطوة 4.1.3 في فترات مختلفة: 5 ثوان و 20 ثانية و 50 ثانية و 100 ثانية.
  2. سجل الهضم في المعدة.
    1. سجل الامتزاز21 في المنطقة البينية المحددة لمدة 10 ثوان.
    2. تبادل الطور الفرعي7 مع السائل في الصمام 2 (sSGF) وإنزيمات المعدة (الجدول 1) (الشكل التكميلي 2D).
      1. املأ المحقنة اليسرى من الصمام 2. حقن 125 ميكرولتر في الصمام 6 الشعيرات الدموية مع المحقنة اليسرى في 5 ميكرولتر·s−1.
      2. استخراج 125 ميكرولتر من الشعيرات الدموية مع الحقنة اليمنى في 5 ميكرولتر·s−1. قم بتفريغ المحقنة اليمنى للخروج من الصمام 8. كرر الخطوات 4.2.2.1-4.2.2.2 10 مرات لضمان التبادل الكامل.
    3. سجل الامتزاز21 في المنطقة البينية المحددة في الخطوة 4.1.2 لمدة ساعة واحدة (الشكل التكميلي 2B).
    4. سجل الريولوجيا التوسعية8 (الشكل التكميلي 2C).
      1. اضبط سعة التذبذب على 1.25 ميكرولتر ، الفترة 10 ثوان.
      2. سجل امتزاز المنطقة البينية المحددة في الخطوة 4.1.2 لمدة 10 ثوان. كرر في فترات مختلفة: 5 ثوان ، 20 ثانية ، 50 ثانية ، 100 ثانية.
  3. سجل الهضم المعوي.
    1. سجل الامتزاز21 في المنطقة البينية المحددة في الخطوة 4.1.2 لمدة 10 ثوان (الشكل التكميلي 2B).
    2. تبادل الطور الفرعي7 مع السائل في الصمام 3 (sSIF) والإنزيمات المعوية / الأملاح الصفراوية / الدهون الفوسفاتية (الجدول 1) (الشكل التكميلي 2D).
      1. املأ المحقنة اليسرى من الصمام 2. حقن 125 ميكرولتر في الصمام 6 الشعيرات الدموية مع المحقنة اليسرى في 5 ميكرولتر·s−1. استخراج 125 ميكرولتر من الشعيرات الدموية مع الحقنة اليمنى في 5 ميكرولتر·s−1.
      2. قم بتفريغ المحقنة اليمنى للخروج من الصمام 8. كرر الخطوات 4.3.2.1-4.3.2.2 10 مرات لضمان التبادل الكامل.
    3. سجل الامتزاز21 في المنطقة البينية المحددة في الخطوة 4.1.2 لمدة 1 ساعة.
    4. سجل الريولوجيا التوسعية8 (الشكل التكميلي 2C).
      1. اضبط سعة التذبذب على 1.25 ميكرولتر ، الفترة 10 ثوان.
      2. سجل الامتزاز في المنطقة البينية المحددة في الخطوة 4.1.2 لمدة 10 ثوان.
      3. كرر في فترات مختلفة: 5 ثوان ، 20 ثانية ، 50 ثانية ، 100 ثانية.
  4. سجل الامتزاز باتباع الخطوات أدناه.
    1. سجل الامتزاز21 في المنطقة البينية المحددة في الخطوة 4.1.2 لمدة 10 ثوان (الشكل التكميلي 2B).
    2. تبادل الطور الفرعي7 مع السائل في الصمام 5 (sSIF) (الجدول 1 ، الشكل التكميلي 2D).
      1. املأ المحقنة اليسرى من الصمام 5. حقن 125 ميكرولتر في صمام 5 شعري مع المحقنة اليسرى في 5 ميكرولتر · ثانية − 1.
      2. استخراج 125 ميكرولتر من الشعيرات الدموية مع الحقنة اليمنى في 5 ميكرولتر·s−1. قم بتفريغ المحقنة اليمنى للخروج من الصمام 8. كرر الخطوات 4.4.2.1-4.4.2.2 10 مرات لضمان التبادل الكامل.
    3. سجل الامتزاز21 في المنطقة البينية المحددة في الخطوة 4.1.2 لمدة ساعة واحدة (الشكل التكميلي 2B).
    4. سجل الريولوجيا التوسعية8 (الشكل التكميلي 2C).
      1. الحفاظ على سعة 1.25 ميكرولتر ، الفترة 10 ثانية.
      2. سجل الامتزاز في المنطقة البينية المحددة في الخطوة 4.1.2 لمدة 10 ثوان.
      3. كرر الخطوة 4.4.4 في فترات مختلفة: 5 ثوان ، 20 ثانية ، 50 ثانية ، 100 ثانية.

5. إعداد التجربة

  1. املأ أنابيب الطرد المركزي الدقيقة بوسائط الهضم الاصطناعية وقم بتوصيل كل منها بالصمام المعني بواسطة الأنبوب المقابل.
  2. املأ الأنبوب في الصمامات 2-5 عن طريق التنظيف من الصمام 2 والصمام 3 والصمام 4 والصمام 5 إلى المخرج الخارجي (الصمام 8) (الشكل التكميلي 1 أ).
  3. املأ الأنبوب في الصمام 1 عن طريق التنظيف من الصمام 1 إلى الصمام 6 شعري 5 مرات.
  4. ضع الشعيرات الدموية في مرحلة الزيت. قم بتحميل المحقنة اليسرى بالصمام 1 (الحل الأولي ، الجدول 1).
  5. ابدأ في المعالجة بالتتابع للخطوة 4.1 الأولية ، والخطوة 4.2 المعدة ، والخطوة 4.3 - الأمعاء ، والخطوة 4.4 - الامتزاز ، مع حفظ البيانات في نهاية كل عملية.

6. حساب المعلمات الريولوجية التوسعية باستخدام برنامج معالجة الصور CONTACTO8

ملاحظة: للحصول على التفاصيل، انظر مالدونادو فالديراما وآخرون 8.

  1. قم بتحميل الصور المقابلة لتذبذب المنطقة بتردد وسعة معينين (الشكل التكميلي 3 أ).
  2. اضغط على الريولوجيا (الشكل التكميلي 3B) واحصل على المعلمات التوسعية (الشكل التكميلي 3C).
  3. انسخ النتائج والصقها في ورقة بيانات البيانات.

7. رسم النتائج التجريبية

  1. أعد حساب عمود الوقت في كل خطوة من خطوات عملية الهضم عن طريق إضافة البيانات الأخيرة لوقت الخطوة السابقة.
  2. ارسم التوتر السطحي مقابل الوقت الإضافي لكل خطوة من خطوات عملية الهضم المستخدمة.
  3. ارسم التوتر السطحي النهائي / المرونة التوسعية واللزوجة التي تم الحصول عليها في نهاية كل خطوة مقابل مرحلة الهضم: الهضم الأولي ، والهضم المعدي ، وهضم الاثني عشر ، والامتزاز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يعرض هذا القسم أمثلة مختلفة لملفات تعريف الهضم المقاسة باستخدام الأخطبوط. يظهر المظهر العام لمطابقات ملف الهضم المحاكي في الشكل 4 ب. عادة ما يتم تمثيل التوتر السطحي ضد الوقت في ملف الهضم. يتم تمثيل المراحل المختلفة / خطوات الهضم التي تم النظر فيها بألوان مختلفة. تشكل المرحلة الأولى الطبقة الأولية وتتوافق مع مرحلة الامتزاز للمستحلب أو البروتين / الفاعل بالسطح / البوليمر ، اعتمادا على كل حالة. بعد ذلك، تحقن السوائل الهضمية المختلفة عن طريق تبادل الطور الفرعي في محلول سائب يحتوي على الوسائط الجديدة. تنتج المرحلة الفرعية الجديدة تغييرات في التوتر البيني لطبقة المستحلب الأولية وفي الريولوجيا التوسعية المقاسة في نهاية كل خطوة هضمية. يمكن أن تتكون عملية الهضم من ثماني خطوات هضمية كحد أقصى.

Figure 5
الشكل 5: مثال على ملامح الهضم في المعدة. أ: التحلل البروتيني المعدي لألبومين مصل الإنسان. يتم تطبيق الوسائط الهضمية عن طريق تبادل الطور الفرعي مع الحلول المفصلة في القسم التجريبي عند T = 37 °C. الأزرق: المخزن المؤقت الأولي مع البروتين ، الأحمر: sSGF مع البيبسين. أعيد طبعها بإذن من ديل كاستيلو سانتايلا وآخرون 12. ب: تحلل الدهون في المعدة من البكتين الموالح. يتم تطبيق الوسائط الهضمية عن طريق تبادل الطور الفرعي مع الحلول المفصلة في القسم التجريبي عند T = 37 °C. الأزرق: المخزن المؤقت الأولي مع البكتين الحمضيات ، الأصفر: sSGF مع الليباز المعدة ، الرمادي: sSGF. أعيد طبعها بإذن من Infantes-Garcia et al.17. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يوضح الشكل 5 بعض النتائج التجريبية التي تم الحصول عليها لهضم المستحلبات في المعدة . في الشكل 5 أ ، يتم امتصاص ألبومين المصل البشري (HSA)12 أولا على واجهة زيت الزيتون والماء ، مما يقلل من التوتر السطحي للوصول إلى هضبة بعد 1 ساعة. في نهاية هذه المرحلة ، يتم قياس الريولوجيا عند 0.1 هرتز (10 ثوان) من التردد (الفترة). في الخطوة الثانية ، تتم إضافة sSGF مع البيبسين عن طريق تبادل الطور الفرعي. يتكون هذا من إدخال حجم مع حقنة واحدة أثناء استخراج نفس الحجم مع المحقنة الأخرى. بهذه الطريقة ، لا تتغير مساحة القطرة ، مما يحافظ على المكونات الممتصة بشكل لا رجعة فيه في واجهة الزيت والماء. يتكرر التبادل بين 10-15 مرة. أثناء تبادل الطور الفرعي مع sSGF والبيبسين ، يزداد التوتر السطحي بسبب التحلل المائي للبروتين ، مما يخفف طبقة البروتين الأولية (الشكل 5 أ). في الشكل 5 ب ، يمتص بكتين الحمضيات (CP) 17 على ماء زيت الدهون الثلاثية لمدة 40 دقيقة ، يليه الريولوجيا التوسعية عند 0.1 هرتز. في الخطوة الثانية ، يتم حقن sSGF مع الليباز المعدي في الجزء الأكبر من القطرة. على العكس من التحلل البروتيني ، يؤدي تحلل الدهون إلى امتزاز الليباز وتشكيل الأحماض الدهنية ، التي تبقى في الواجهة ، مما يقلل من التوتر السطحي. مرحلة الامتزاز هي الخطوة الثالثة ، التي تقيم إنتاج ماء أو إذابة المنتجات المحبة للدهون من تحلل الدهون. يوضح الشكل 5B أن تبادل الطور الفرعي مع sSGF يوفر استجابة فارغة للتوتر البيني. يمكن تفسير ذلك على أنه إنتاج منتجات هضمية محبة للدهون ، والتي تمتز بشكل لا رجعة فيه ولا تذوب ، وتبقى مثبتة في الواجهة. عدم وجود الأملاح الصفراوية في مرحلة المعدة هو المسؤول عن عدم وجود الذوبان. يمكن تحليل درجة تحلل الدهون نوعيا من خلال قيمة التوتر السطحي الذي تم الوصول إليه.

Figure 6
الشكل 6: مثال على ملامح الهضم المعوي . (أ) ملامح الامتزاز والامتزاز للأملاح الصفراوية (المربعات السوداء) ، والليباز (المثلثات الرمادية) ، والليباز + الأملاح الصفراوية (المعينيات البرتقالية) في sSIF عند 37 درجة مئوية. أعيد طبعها بإذن من Macierzanka et al.13. (ب) امتزاز الأملاح الصفراوية + الليباز على F68 الممتز سابقا (أخضر غامق) و F127 (أخضر فاتح) ، امتزاز الأملاح الصفراوية (أصفر) في sSIF. الامتزاز: تبادل الطور الفرعي مع sSIF على الأملاح الصفراوية (برتقالي) ، F68 (أرجواني غامق) ، و F127 (أرجواني فاتح). أعيد طبعها بإذن من Torcello-Gómez et al.19. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يوضح الشكل 6 النتائج التجريبية التي تم الحصول عليها للهضم المعوي للمستحلبات. على عكس الهضم المعدي ، فإن وجود الأملاح الصفراوية في الأمعاء الدقيقة يوفر ملامح امتصاص مختلفة عند تبادل الطور الفرعي مع sSIF واستنفاد المحلول السائب. يوضح الشكل 6 أ ملامح الامتزاز التي تم الحصول عليها للأملاح الصفراوية النقية والليباز النقي والليباز المختلط / الأملاح الصفراوية8،9،10،13. تمتص الأملاح الصفراوية بشكل عكسي على واجهة الزيت والماء ، وبالتالي ، يتم امتصاصها بالكامل عند تبادل الطور الفرعي مع sSIF ، كما يتضح من الزيادة في التوتر السطحي للوصول إلى قيمة واجهة الزيت والماء العارية 8,13. على العكس من ذلك ، يمتص الليباز بشكل لا رجعة فيه ، كما هو موضح في القيمة الثابتة للتوتر البيني بعد تبادل الطور الفرعي بواسطة sSIF. يوفر خليط الليباز والأملاح الصفراوية ملف امتصاص وسيط يتم تحديده كميا من خلال زيادة محدودة في التوتر البيني عند تبادل الطور الفرعي بواسطة sSIF إلى قيمة وسيطة. تحتوي الطبقة البينية المتبقية على الليباز والأحماض الدهنية الحرة. ربما تمتص الأملاح الصفراوية من الواجهة وتذوب بعض الأحماض الدهنية الحرة المتكونة في تحلل الدهون. يوضح الشكل 6B تطور التوتر السطحي عند تحلل الدهون لنوعين مختلفين من Pluronic: F127 و F6819. يوضح الشكل 6B انخفاضا حادا في التوتر البيني بسبب امتزاز الليباز والأملاح الصفراوية وإنتاج الأحماض الدهنية الحرة على الأفلام البينية المشكلة مسبقا من F68 و F127 عند واجهة الزيت والماء. تظهر خطوة الامتزاز التوتر البيني المتزايد الناجم عن تبادل الطور الفرعي مع sSIF ، والذي يحدد كمية إذابة المنتجات المحللة للدهون.

Figure 7
الشكل 7: مثال على ملامح الهضم المعدية المعوية الديناميكية الكاملة . (أ) ملف الهضم في المختبر لفيلم AS-48 الممتز في واجهة الهواء والماء. يتم تطبيق الوسائط الهضمية عن طريق تبادل الطور الفرعي مع الحلول المفصلة في القسم التجريبي عند T = 37 °C. التحكم: المخزن المؤقت الأولي مع AS-48 ، البيبسين: sSGF مع البيبسين ، التربسين: sSIF مع التربسين + الكيموتريبسين ، الامتزاز: sSIF. أعيد طبعها بإذن من ديل كاستيلو سانتايلا وآخرون 18. (ب) ملف الهضم في المختبر لأغشية الألبومين الممتصة في مصل الدم البشري والبقري عند واجهة زيت الزيتون والماء. يتم تطبيق الوسائط الهضمية عن طريق تبادل الطور الفرعي مع الحلول المفصلة في القسم التجريبي عند T = 37 °C. التحكم: المخزن المؤقت الأولي مع HSA / BSA ، البيبسين: sSGF مع البيبسين ، التربسين: sSIF مع التربسين + الكيموتريبسين ، تحلل الدهون: sSIF مع الليباز والأملاح الصفراوية ، الامتزاز: sSIF. المنحنيات المرسومة هي تجارب تمثيلية مع انحرافات <5٪. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يوضح الشكل 7 أمثلة على ملفات تعريف الهضم المحاكية الكاملة. يوضح الشكل 7A ملف الهضم للمواد الحافظة الحيوية للأغذية AS-48 الممتصة عند واجهة الهواء والماء18. تم تصميم عملية الهضم للتركيز على التحلل البروتيني لهذا الببتيد ، في حين لم تكن هناك حاجة إلى تحلل الدهون في الزيت ، حيث يتم في واجهة الهواء والماء. ومن ثم، فإن الهضم المحاكي في الشكل 7 أ يتكون من خمس خطوات: طبقة التحكم/الغشاء، وانحلال الببسين، وانحلال التريبسين، والامتزاز. أظهرت النتائج العملية أن هذه البكتيريا مقاومة لكل من التحلل المائي للبيبسين والتريبسين حيث ظل التوتر السطحي دون تغيير. وفقا لذلك ، تم اعتبار AS-48 مادة حافظة حيوية غذائية جيدة مقاومة للهضم في المختبر . يقارن الشكل 7B ملامح الهضم في المختبر للطبقات الممتصة من ألبومينات مصل الدم البشري والبقري الممتصة عند واجهة الزيت والماء22. تم تصميم هذه المحاكاة لتقليد هضم المستحلبات التي استقرت بواسطة هذين البروتينين23 وتقييم تغليف الكركمين4. ومن ثم ، تم تخصيص الهضم المحاكي الذي يتألف من خمس خطوات: التحكم / الأولي ، انحلال البيبسين ، انحلال التربسينو ، تحلل الدهون ، والامتزاز. أظهرت النتائج التجريبية زيادة التوتر السطحي بعد هضم البيبسين ، مما يشير إلى زيادة التعرض لانحلال الببسين. ويعزى ذلك إلى زيادة تكشف البديل البقري عند الامتزاز ، مما يعرض المواقع الحساسة للبيبسين. بعد ذلك ، قدم انحلال التربسينات وتحلل الدهون ملفات هضم متشابهة تماما (الشكل 7 ب).

Figure 8
الشكل 8: مثال على القيم النهائية لعملية الهضم في الجهاز الهضمي. (أ) التوتر السطحي، (ب) المرونة التوسعية، (ج) اللزوجة التوسعية للهضم في المختبر للغشاء الممتز β-lactoglobulin عند واجهة زيت الزيتون والماء. تم قياس المعلمات التوسعية عند 1 هرتز و 0.1 هرتز و 0.01 هرتز بعد موازنة الواجهة المهضومة في كل خطوة. يتم تطبيق الوسائط الهضمية عن طريق تبادل الطور الفرعي مع الحلول المفصلة في القسم التجريبي عند T = 37 °C. التحكم: المخزن المؤقت الأولي مع البروتين ، البيبسين: sSGF مع البيبسين ، التربسين: sSIF مع التربسين + الكيموتريبسين ، تحلل الدهون: sSIF مع الليباز والأملاح الصفراوية ، الامتزاز: sSIF. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

بشكل عام ، من أجل تقييم ومقارنة طبيعة الطبقات البينية المهضومة المختلفة ، يتم رسم التوتر السطحي النهائي والمرونة / اللزوجة التوسعية التي تم الحصول عليها للواجهات المهضومة لكل خطوة من الخطوات التي تم أخذها في الاعتبار في عملية الهضم المصممة. يوضح الشكل 8 التوتر البيني (الشكل 8 أ) ، والمرونة التوسعية (الشكل 8 ب) ، واللزوجة التوسعية (الشكل 8 ج) ، المقاسة بترددات 1 هرتز و 0.1 هرتز و 0.01 هرتز. تم الحصول على القيم المرسومة بعد كل خطوة هضمية من β-lactoglobulin الممتصة في واجهة الزيت والماء16. يوضح الشكل 8 أ أن التحلل البروتيني (الببسين والتريبسين) ينتج زيادات صغيرة في التوتر السطحي ، بينما يقلل تحلل الدهون من هذه القيمة ، ويزداد الامتزاز مرة أخرى. فيما يتعلق بالمرونة التوسعية ، يشكل البروتين أفلاما مرنة ومترابطة في واجهة الزيت والماء. ينتج عن وجود الأملاح الصفراوية أفلام بينية متحركة وسائلة للغاية ذات مرونة منخفضة. أخيرا ، لا يمكن للمنتجات المحللة للدهون المتبقية تطوير فيلم مرن متماسك بعد الامتزاز. تزداد المرونة التوسعية قليلا مع تردد التذبذب (الشكل 8 ب). أخيرا ، لا يمكن اكتشاف اللزوجة التوسعية للأفلام البينية الموضحة في الشكل 8C إلا عند التردد المنخفض وتكتشف وجود طبقات متعددة أو مجاميع أو هياكل تبديد أخرى في الواجهة. أظهرت مقارنة ملف الهضم ل β-lactoglobulin مع ملف الهضم الذي تم الحصول عليه ل β-lactoglobulin المعالج بالنبض تحسنا في هضم البروتينات الخاضعة لهذا النوع من العلاج الطبيعي16.

المخزن المؤقت الأولي 0.00113 مول L-1 NaH2PO4 ، درجة الحموضة 7.0
سائل المعدة المحاكي المبسط (sSGF) [NaH2PO4] = 0.00113 مول L-1 ، [كلوريد الصوديوم] = 0.15 مول L-1 ، درجة الحموضة 3.0
السائل المعوي المحاكي المبسط (sSIF) [NaH2PO4] = 0.00113 مول L-1 ، [كلوريد الصوديوم] = 0.15 مول L-1 ، [CaCl2] = 0.003 مول L-1 ، درجة الحموضة 7.0
إنزيمات المعدة بيبسين (50 ∙ 10 3 U L-1) ، ليباز المعدة (0.5 ∙ 103 U L-1)
الانزيمات المعوية التربسين (2.5 ∙ 10 3 U L-1) ، كيموتريبسين (0.625 ∙ 10 3 U L-1) ، ليباز البنكرياس (50∙ 10 3 U L-1) ، الليباز المشترك (150 ∙ 10 3 U L-1)
خليط الأملاح الصفراوية 0.01 مول L-1 M. خليط الأملاح الصفراوية: توروكولات الصوديوم وديوكسي كولات الصوديوم (50/50) أو توروكولات الصوديوم والصوديوم غليكودوكسي كولات (50/50)

الجدول 1: تكوين وسط الجهاز الهضمي الاصطناعي.

الشكل التكميلي 1: العمليات الأساسية لواجهة الكمبيوتر DINATEN. (أ) المظهر العام للواجهة الحاسوبية DINATEN ؛ يظهر مربع الحوار الأيسر الحققنتين المتصلتين بجميع الصمامات ويتحكم في الحقن / الاستخراج والتنظيف. يحتوي مربع الحوار المركزي على الأمر وصورة الإفلات والجدول الذي يحتوي على النتائج. (ب) يوفر الحساب في الوقت الفعلي القياس التلقائي كدالة للزمن. (ج) الأمر الأيسر لتضمين الكثافة التفاضلية. (د) تتحكم عملية ديناميكية بسيطة في حجم الحقن / الاستخراج ومعدله وأوقات التقاطه. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: واجهة برمجة كل خطوة هضمية (عملية). (أ) تكوين السقوط باستخدام محقنة يسرى ذات حجم ثابت ومعدل حقن ثابت. (ب) الامتزاز في منطقة بينية ثابتة: التحكم. ج: الريولوجيا ذات السعة والدورة وعدد الدورات الثابتة. د: تبادل الطور الفرعي: الحقن والاستخراج باستخدام كلتا الحقابتين بنفس المعدل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: حساب المعلمات التوسعية باستخدام برنامج تحليل الصور CONTACTO. (أ) تحليل الصور المقابلة للاهتزاز في فترة محددة. (ب) حساب المعلمات التوسعية للطبقة البينية للصور المختارة. (ج) مربع حوار يوضح نتائج التحليل التوسعي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توضح هذه المقالة بروتوكولا معمما لقياس الهضم في المختبر للطبقات البينية باستخدام معدات إسقاط قلادة. يمكن تعديل البروتوكول وفقا للمتطلبات المحددة للتجربة عن طريق ضبط تكوين المخازن الهضمية ، والتي تستند إلى بروتوكول INFOGEST11,20 المنسق لتسهيل المقارنة مع الأدبيات. يمكن إضافة الإنزيمات الهاضمة والمواد الخافضة للتوتر السطحي بشكل فردي أو بالتتابع أو معا. يجب إجراء هذا الخيار الأخير بعناية لأن تشبع الطبقة البينية من شأنه أن يعيق الظواهر المختلفة من خلال توفير توتر بيني منخفض للغاية ويمكن أن يتسبب في سقوط القطرة. من أجل أن تكون قادرة على تحليل تأثير كل مكون هضمي ، تتم إضافة الإنزيمات الهضمية المختلفة بالتتابع وبتركيزات مختلفة. بهذه الطريقة ، يمكن تحليل تأثيرات كل مكون وتنظيمها ، ويتم تقييم أوجه التآزر عن طريق الإضافة المتسلسلة. أيضا ، لمنع قطرات من السقوط ، يتم تخفيف بعض التركيزات9. لا يمكن استقراء النتائج التي تم الحصول عليها مباشرة إلى الأنظمة المستحلبة حيث يتم تعديل الظروف لمراعاة نظام مبسط. ومع ذلك ، فإن تطور التوتر البيني يظهر تطور التغطية البينية حيث يتم هضم الطبقة البينية10. وبالمثل ، يوفر تطور الريولوجيا التوسعية بعض المعلومات حول الخواص الميكانيكية للواجهة مع استمرار عملية الهضم9. تحتوي هذه النتائج على معلومات مفيدة يمكن تكييفها وتفسيرها بعناية لتطبيقها على الأنظمة المستحلبة.

تسمح معدات إسقاط القلادة بتقييم الأحداث في الموقع التي تحدث على وجه التحديد في الطبقة البينية ، كما هو موضح في الشكل 2. أولا ، يتم تشكيل طبقة بينية أولية ، تمثل قطرة مستحلب واحدة. تخضع هذه الطبقة الأولية لظروف هضمية مختلفة وتغير تكوينها بالتتابع بسبب وجود المكونات المختلفة في المرحلة المائية. أيضا ، يجب أن تتغلب الليباز على هذه الطبقة البينية للوصول إلى مرحلة الزيت وتحلل الدهون. يجب تقييم هذه الأحداث البينية في نفس الطبقة البينية التي تم إنشاؤها في البداية. إن إخضاع المستحلب للهضم في المختبر سيسمح بأخذ العينات في أوقات مختلفة وتقييم التغييرات في المستحلب أثناء هضمه (حجم القطرة ، إمكانات زيتا) ، لكنه لن يسمح بالتقييم في الموقع للطبقة البينية المحيطة بكل قطرة مستحلب. ومن ثم ، فإن معدات إسقاط القلادة المنفذة مع التبادل متعدد الأطوار الفرعية تشتمل على تقنية تكميلية للتركيز على الهندسة البينية للمستحلبات14.

يرتبط القيد الأول لهذه المنهجية على وجه التحديد بتشبع الطبقة البينية بمنتجات متنوعة ، والتي يجب تخفيفها لمنع سقوط القطرة. هناك مشكلة تجريبية أخرى تتمثل في إزالة الغازات من جميع الوسائط الاصطناعية لتجنب نواة الفقاعات ، والتي يمكن أن تسبب أيضا انفصال القطيرات عن الشعيرات الدموية. من المهم أيضا مراعاة نسبة الزيت إلى الماء الأكبر مقارنة بأنظمة المستحلب عند استقراء الأنظمة المستحلبة. أخيرا ، على الرغم من أن الريولوجيا التوسعية تحتوي على معلومات حول الارتباطات بين الجزيئات وداخلها داخل الطبقة البينية ، التي تشكلها وتعطلها الإنزيمات الهضمية ، إلا أنه من الصعب تفسير واستقراء استقرار المستحلب. إجمالا ، تعد قطرة القلادة التي يتم تنفيذها باستخدام جهاز تبادل متعدد الأطوار الفرعية قطعة مفيدة من المعدات لاستكمال دراسات الهضم في المختبر للمستحلبات12 ، والتي تتبع تطور توزيع حجم القطيرات وإمكانات زيتا لهضم البروتين مع الكهربائي22. تشمل تعديلات الجهاز الهضمي لمراعاة الاختلاف بين الجنسين أو هضم الرضع أو مشاكل الجهاز الهضمي التطبيقات المستقبلية للإجراء التجريبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية يمكن أن تؤثر على العمل المذكور في هذه الورقة.

Acknowledgments

تم تمويل هذا البحث من قبل المشاريع RTI2018-101309-B-C21 و PID2020-631-116615RAI00 ، بتمويل من MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 ومن قبل "ERDF طريقة لصنع أوروبا". تم دعم هذا العمل (جزئيا) من قبل مجموعة فيزياء الغروانية الحيوية والسوائل (المرجع PAI-FQM115) بجامعة غرناطة (إسبانيا).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha-chymotrypsin from bovine pancreas Sigma-Aldrich C4129 Enzyme
Beta-lactoglobulin Sigma-Aldrich L0130 Emulsfier
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich 9048-46-8 Emulsfier
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4 Electrolyte
Centrifuge Kronton instruments Centrikon T-124 For separating oil and resins
Citrus pectin Sigma-Aldrich P9135 Emulsfier
co-lipase FROM PORCINE PANCREAS Sigma C3028 Enzyme
CONTACTO University of Granada (UGR) https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
DINATEN University of Granada (UGR) https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
Gastric lipase Lipolytech RGE15-1G Enzyme
Human Serum Albumin Sigma-Aldrich 70024-90-7 Emulsifier
INFOGEST http://www.proteomics.ch/IVD/
Lipase from porcine pancreas, type II Sigma-Aldrich L33126 Enzyme
Magnesium metasilicate resins Fluka 1343-88-0 Resins to purify oil
Micro 90 International products M-9051-04 Cleaner
NaCl Sigma 7647-14-5 Electrolyte
NaH2PO4 Scharlau 10049-21-5 To prepare buffer
OCTOPUS Producciones Científicas y Técnicas S.L. (Gójar, Spain) Pendandt Drop Equipment implemented with multi subphase exchange
Olive oil Sigma-Aldrich 1514 oil
Pancreatic from porcine pancreas Sigma P7545-25 g Enzyme
Pepsin Sigma-Aldrich P6887 Enzyme
Pluronic F127 Sigma P2443 Emulsifier
Pluronic F68 Sigma P1300 Emulsfier
Sodium deoxycholate Sigma Bile salts
Sodium glycodeoxycholate Sigma C9910 Bile salts
Sodium taurocholate Sigma 86339 Bile salts
Syringe Filter Millex-DP SLGP033R  Syringe Filter 0.22 µm pore size polyethersulfone
Trypsin Sigma-Aldrich T1426 Enzyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McClements, D. J. The biophysics of digestion: Lipids. Current Opinion in Food Science. 21, 1-6 (2018).
  2. McClements, D. J., Li, Y. Structured emulsion-based delivery systems: Controlling the digestion and release of lipophilic food components. Advances in Colloid and Interface Science. 159 (2), 213-228 (2010).
  3. Corstens, M. N., et al. Food-grade micro-encapsulation systems that may induce satiety via delayed lipolysis: A review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2218-2244 (2017).
  4. Aguilera-Garrido, A., del Castillo-Santaella, T., Galisteo-González, F., Gálvez-Ruiz, M. J., Maldonado-Valderrama, J. Investigating the role of hyaluronic acid in improving curcumin bioaccessibility from nanoemulsions. Food Chemistry. 351, 129301 (2021).
  5. Rodríguez Patino, J. M., Carrera Sánchez, C., Rodríguez Niño, M. R. Implications of interfacial characteristics of food foaming agents in foam formulations. Advances in Colloid and Interface Science. 140 (2), 95-113 (2008).
  6. Wilde, P. J., Chu, B. S. Interfacial & colloidal aspects of lipid digestion. Advances in Colloid and Interface Science. 165 (1), 14-22 (2011).
  7. Cabrerizo-Vílchez, M. A., Wege, H. A., Holgado-Terriza, J. A., Neumann, A. W. Axisymmetric drop shape analysis as penetration Langmuir balance. Review of Scientific Instruments. 70 (5), 2438-2444 (1999).
  8. Maldonado-Valderrama, J., Muros-Cobos, J. L., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. Bile salts at the air-water interface: Adsorption and desorption. Colloids and surfaces B: Biointerfaces. 120, 176-183 (2014).
  9. Maldonado-Valderrama, J., Terriza, J. A. H., Torcello-Gómez, A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. In vitro digestion of interfacial protein structures. Soft Matter. 9, 1043-1053 (2013).
  10. Maldonado-Valderrama, J. Probing in vitro digestion at oil-water interfaces. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 39, 51-60 (2019).
  11. Brodkorb, A., et al. INFOGEST static in vitro simulation of gastrointestinal food digestion. Nature Protocols. 14 (4), 991-1014 (2019).
  12. del Castillo-Santaella, T., Maldonado-Valderrama, J., Molina-Bolivar, J. A., Galisteo-Gonzalez, F. Effect of cross-linker glutaraldehyde on gastric digestion of emulsified albumin. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 145, 899-905 (2016).
  13. Macierzanka, A., Torcello-Gómez, A., Jungnickel, C., Maldonado-Valderrama, J. Bile salts in digestion and transport of lipids. Advances in Colloid and Interface Science. 274, 102045 (2019).
  14. Maldonado-Valderrama, J., Torcello-Gómez, A., del Castillo-Santaella, T., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. Subphase exchange experiments with the pendant drop technique. Advances in Colloid and Interface Science. 222, 488-501 (2015).
  15. Bellesi, F. A., Ruiz-Henestrosa, V. M. P., Maldonado-Valderrama, J., Del Castillo Santaella, T., Pilosof, A. M. R. Comparative interfacial in vitro digestion of protein and polysaccharide oil/water films. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 161, 547-554 (2018).
  16. Del Castillo-Santaella, T., Sanmartín, E., Cabrerizo-Vílchez, M. A., Arboleya, J. C., Maldonado-Valderrama, J. Improved digestibility of β-lactoglobulin by pulsed light processing: A dilatational and shear study. Soft Matter. 10 (48), 9702-9714 (2014).
  17. Infantes-Garcia, M. R., et al. In vitro gastric lipid digestion of emulsions with mixed emulsifiers: Correlation between lipolysis kinetics and interfacial characteristics. Food Hydrocolloids. 128, 107576 (2022).
  18. del Castillo-Santaella, T., Cebrián, R., Maqueda, M., Gálvez-Ruiz, M. J., Maldonado-Valderrama, J. Assessing in vitro digestibility of food biopreservative AS-48. Food Chemistry. 246, 249-257 (2018).
  19. Torcello-Gómez, A., Maldonado-Valderrama, J., Jódar-Reyes, A. B., Cabrerizo-Vílchez, M. A., Martín-Rodríguez, A. Pluronic-covered oil-water interfaces under simulated duodenal conditions. Food Hydrocolloids. 34, 54-61 (2014).
  20. Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international consensus. Food & Function. 5 (6), 1113-1124 (2014).
  21. Wege, H. A., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. A. Development of a constant surface pressure penetration langmuir balance based on axisymmetric drop shape analysis. Journal of Colloid and Interface Science. 249 (2), 263-273 (2002).
  22. del Castillo-Santaella, T., et al. Hyaluronic acid and human/bovine serum albumin shelled nanocapsules: Interaction with mucins and in vitro digestibility of interfacial films. Food Chemistry. 383, 132330 (2022).
  23. Aguilera-Garrido, A., et al. Applications of serum albumins in delivery systems: Differences in interfacial behaviour and interacting abilities with polysaccharides. Advances in Colloid and Interface Science. 290 (5), 102365 (2021).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 189 ،
<em>في المختبر</em> هضم المستحلبات في قطرة واحدة <em>عن طريق</em> تبادل متعدد الأطوار الفرعية لسوائل الجهاز الهضمي المحاكاة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maldonado-Valderrama, J., del… More

Maldonado-Valderrama, J., del Castillo Santaella, T., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. Á. In vitro Digestion of Emulsions in a Single Droplet via Multi Subphase Exchange of Simulated Gastrointestinal Fluids. J. Vis. Exp. (189), e64158, doi:10.3791/64158 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter