In vivo Imaging del calcio a campo largo e a due fotoni da un topo utilizzando una grande finestra cranica

Summary

Il presente protocollo descrive la realizzazione di una grande finestra cranica (6 x 3 mm²) utilizzando un involucro alimentare, silicone trasparente e vetro di copertura. Questa finestra cranica consente esperimenti di imaging di calcio a campo largo e a due fotoni in vivo nello stesso topo.

Abstract

L’imaging del calcio ad ampio campo dalla neocorteccia del topo consente di osservare l’attività neurale a livello di corteccia correlata a varie funzioni cerebrali. D’altra parte, l’imaging a due fotoni può risolvere l’attività dei circuiti neurali locali a livello di singola cellula. È fondamentale creare una grande finestra cranica per eseguire analisi su più scale utilizzando entrambe le tecniche di imaging nello stesso topo. Per raggiungere questo obiettivo, è necessario rimuovere un’ampia sezione del cranio e coprire la superficie corticale esposta con materiali trasparenti. In precedenza, teschi di vetro e finestre craniche a base di polimeri sono stati sviluppati per questo scopo, ma questi materiali non sono facilmente fabbricabili. Il presente protocollo descrive un metodo semplice per realizzare una grande finestra cranica costituita da un film di avvolgimento in cloruro di polivinilidene (PVDC) disponibile in commercio, un tappo di silicone trasparente e un vetro di copertura. Per l’imaging della superficie dorsale di un intero emisfero, la dimensione della finestra era di circa 6 x 3 mm². Forti vibrazioni cerebrali non sono state osservate indipendentemente da una finestra così grande. È importante sottolineare che le condizioni della superficie cerebrale non si sono deteriorate per più di un mese. L’imaging ad ampio campo di un topo che esprime un indicatore di calcio geneticamente codificato (GECI), GCaMP6f, in particolare negli astrociti, ha rivelato risposte sincronizzate in pochi millimetri. L’imaging a due fotoni dello stesso topo ha mostrato risposte di calcio prominenti nei singoli astrociti per diversi secondi. Inoltre, un sottile strato di un virus adeno-associato è stato applicato al film PVDC e ha espresso con successo GECI nei neuroni corticali sopra la finestra cranica. Questa tecnica è affidabile ed economica per realizzare una grande finestra cranica e facilita l’indagine delle dinamiche neurali e gliali e delle loro interazioni durante il comportamento a livello macroscopico e microscopico.

Introduction

L’imaging del calcio ad ampio campo studia efficacemente il modello di attività spaziotemporale su una vasta area del cervello animale ^1,2,3. L’imaging ad ampio campo è stato ampiamente utilizzato per osservare l’intera superficie corticale dei roditori poiché la loro corteccia è relativamente piatta 2,3,4,5,6,7,8,9,10. Topi transgenici o topi iniettati con virus adeno-associato (AAV), che esprimono specificamente GECI in varie cellule come neuroni e cellule gliali, possono essere utilizzati per l’imaging del calcio ad ampio campo^11,12,13. Tuttavia, la risoluzione spaziale di questa tecnica di solito non è sufficiente per risolvere l’attività delle singole cellule in vivo¹⁴. Inoltre, non è adatto per l’imaging di cellule situate in strati più profondi.

D’altra parte, l’imaging del calcio a due fotoni può osservare l’attività di più cellule contemporaneamente con risoluzione spaziale subcellulare, consentendo l’osservazione dell’attività delle singole cellule anche nei dendriti neuronali e nei processi gliali 15,16,17,18,19,20,21,22. Può anche osservare le cellule negli strati più profondi della corteccia cerebrale^23,24. Sebbene i recenti progressi tecnologici nella microscopia a due fotoni consentano l’imaging da regioni corticali larghe millimetriche 25,26,27,28,29^, è ancora difficile osservare un’area paragonabile all’imaging a grande campo mediante imaging a due fotoni.

Per comprendere la rilevanza fisiologica dell’attività cerebrale da singola cellula a cervello intero, è fondamentale colmare il divario tra l’attività delle regioni corticali sull’intera corteccia e quella alla risoluzione di una singola cellula nei circuiti neurali locali. Pertanto, una combinazione di imaging del calcio a campo largo e a due fotoni eseguita nello stesso topo è particolarmente efficace. Per realizzare questo, è necessario creare una finestra cranica ampia e stabile, idealmente per un lungo periodo.

In precedenza, sono state sviluppate diverse tecniche per realizzare finestre craniche per consentire l’imaging a campo largo e a due fotoni nello stesso topo^30,31. Le finestre di vetro di copertura di forma trapezoidale (teschio di cristallo), che sono modellate nella forma della superficie corticale per sostituire l’osso rimosso, consentono l’accesso ottico su tutta la corteccia³². In alternativa, le finestre craniche a base di polimeri possono essere realizzate con polietilene tereftalato (PET)³³ o fluoropolimeri amorfi rivestiti di polietilene nanosheet³⁴. Ogni metodo ha dimostrato di mantenere una finestra stabile per più di 1 mese. Tuttavia, produrre queste finestre non è facile e i materiali e le attrezzature utilizzate sono spesso costosi.

Il presente studio descrive un nuovo metodo per realizzare una grande finestra cranica utilizzando il film PVDC (involucro alimentare in plastica) (Figura 1). Utilizzando questa finestra, esperimenti di imaging a campo largo e a due fotoni in vivo possono essere eseguiti negli stessi topi. È stato anche dimostrato che i GECI potrebbero essere espressi nei neuroni su una vasta area della corteccia dei topi formando un sottile strato di pellicola contenente particelle AAV sull’involucro.

Protocol

Le procedure sperimentali sono state approvate dall’Animal Experiment Committee dell’Università di Yamanashi. In questo studio sono stati utilizzati topi wild-type (C57BL/6J, Japan SLC) e transgenici che esprimono GECI ancorati a membrana (Lck-GCaMP6f) negli astrociti. I topi transgenici sono stati ottenuti incrociando topi AldH1l1-CreERT2 [B6N. FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J, ottenuti commercialmente, vedi Tabella dei materiali] e topi Flx-Lck-GCaMP6f [C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor/J, ottenuti commercialmente] topi. I topi transgenici sono stati trattati con tamoxifene (20 mg/ml) per 5 giorni (0,05 ml/10 g p.c., i.p.) per esprimere GCaMP6f. Tutti i topi utilizzati erano maschi e femmine di almeno 4 settimane. Lo schema della finestra è mostrato nella Figura 1A e la procedura chirurgica è riassunta nella Figura 1B. 1. Preparazione per la chirurgia della finestra cranica Anestetizzare topi con isoflurano (induzione: 3%, chirurgia: 1% -1,5%, portata: 0,2-0,3 L / min). Confermare la profondità dell’anestesia dalla perdita del riflesso della coda o del pizzico della punta. Mantenere la temperatura corporea utilizzando un termoforo (36-38 °C). Applicare un unguento per gli occhi con un batuffolo di cotone per evitare che gli occhi dei topi si secchino sotto anestesia. Iniettare una soluzione di mannitolo al 15% (vedere Tabella dei materiali) per via intraperitoneale (3 ml/100 g di peso corporeo). Fissare la testa del mouse su una cornice stereotassica con barre auricolari. Rimuovere i peli dalla testa del mouse usando un rasoio e una crema depilatoria. Disinfettare la superficie della pelle con povidone-iodio e alcool tre volte. Applicare la lidocaina localmente per fornire analgesia preventiva. Rimuovere la pelle sopra l’area di interesse con forbici chirurgiche ed esporre il cranio (dimensioni: 15 x 15 mm). Se è presente sanguinamento, utilizzare un batuffolo di cotone per fermare l’emorragia.NOTA: In questo studio, la pelle è stata rimossa per osservare la corteccia prefrontale alla corteccia visiva. Rimuovere il periostio sopra il cranio esposto usando una micro curette e asciugare la superficie del cranio per fissare saldamente la piastra della testa al cranio con cemento dentale (vedi Tabella dei materiali) (Figura 2B).NOTA: La piastra frontale personalizzata viene creata utilizzando una stampante 3D. Il file di progettazione viene depositato nel repository Github (https://github.com/Satoshi-Manita/Head-plates). Fissare la piastra frontale con cemento dentale (Figura 2C). Attendere almeno 20 minuti affinché il cemento si indurisca. Fissare la piastra di testa con il supporto della piastra di testa35. 2. Fare la finestra cranica Rimuovere il cemento in eccesso sul cranio con un trapano dentale (vedi Tabella dei materiali). Fare attenzione a non perforare l’osso e danneggiare il cervello perforando. Segna l’area da tagliare con una penna e taglia l’osso con un bisturi. Smussare la punta del bisturi per garantire che la punta non penetri nel cranio (Figura supplementare 1). Fai riferimento all’atlante cerebrale per determinare dove creare la finestra.NOTA: Per il presente studio, è stata creata una finestra compresa tra -2 mm e +4 mm dal bregma nell’asse anteroposteriore e dalla sutura sagittale a +3 mm nell’asse mediolaterale, comprese le cortecce motorie, somatosensoriali e visive. Raschiare ripetutamente l’osso con un bisturi per approfondire il solco fino a quando l’osso nella zona da tagliare si muove bene quando viene leggermente toccato. Rimuovere l’osso inciso con una pinzetta sottile. Non spingere il lembo osseo nel cervello, che potrebbe danneggiare il cervello (Figura 1Ba).NOTA: Se si osserva sanguinamento dopo la rimozione dell’osso, applicare immediatamente e aspirare il liquido cerebrospinale artificiale (ACSF, vedere Tabella dei materiali) e ripetere questo processo fino a quando l’emorragia si arresta. In alternativa, posizionare una spugna di gelatina emostatica (circa 3 mm quadrati cubi) imbevuta di ACSF sul punto di sanguinamento. Se la dura non viene rimossa, procedere al passaggio 2.7. Rimuovere la dura madre seguendo i passaggi seguenti.Rimuovere la dura, ad esempio, nelle seguenti situazioni; trasfezione utilizzando il metodo del film di fibroina-AAV36 e osservando piccole strutture come le spine dendritiche. Tagliare la dura usando una pipetta di vetro tirata con una punta affusolata di circa 10 μm. Per espandere questo taglio su tutta la finestra, utilizzare un ago a forma di U. Impostare lo zoom dello stereomicroscopio su 60-100x e rimuovere la dura madre recisa con una pinzetta ultrafine. Se la rimozione della dura madre provoca sanguinamento, sciacquare con ACSF o utilizzare una spugna di gelatina per fermare l’emorragia. Ritagliare l’involucro PVDC.Sterilizzare un grande pezzo (ad esempio, 10 x 15 mm) di involucro PVDC (circa 11 μm, vedi Tabella dei materiali, Figura 2Aa) mediante autoclave e con etanolo al 70%. Sotto uno stereomicroscopio, utilizzare una pinzetta e un bisturi per ritagliare un involucro della dimensione richiesta.NOTA: La dimensione dell’involucro deve essere circa 10 mm più grande della dimensione della finestra cranica ma più piccola dell’apertura della piastra della testa. Per una finestra cranica di 6 x 3 mm 2, preparare un involucro 15 x 10 mm2. Posizionare accuratamente l’involucro seguendo i passaggi seguenti.Posizionare l’involucro sulla superficie del cervello, lasciando l’ACSF sulla superficie. Aspirare l’ACSF dal bordo dell’involucro, permettendo all’involucro di aderire saldamente alla superficie del cervello (Figura 1Bb,c).NOTA: L’involucro utilizzato è resistente alle rughe, quindi il semplice posizionamento sulla superficie del cervello non produce quasi rughe. Tagliare l’involucro con un bisturi e una pinzetta in modo che ci sia un margine di circa 1 mm tra il bordo della finestra cranica e l’involucro (Figura 1Bd). Una volta che l’involucro è in posizione, incollare il bordo dell’involucro al cranio con un adesivo biologico (vedi Tabella dei materiali, Figura 2D). Lasciare asciugare l’adesivo per circa 30 minuti. Applicare l’elastomero siliconico trasparente.Applicare l’elastomero siliconico trasparente disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) sopra l’involucro utilizzando un dosatore con una punta di miscelazione (Figura 1B e, 2Ab-d)e posizionare il vetro di copertura (spessore 0,12-0,17 mm) sopra (Figura 2E). Sigillare il perimetro del vetro di copertura con pellicola impermeabile, supercolla o cemento dentale (Figura 1Bf). Dopo l’intervento chirurgico, monitorare il topo fino a quando non riprende conoscenza per mantenere la reclinazione sternale. Dopodiché, tieni i topi individualmente e consenti loro di riprendersi nella loro gabbia domestica per almeno 7 giorni.Per ridurre lo stress e il dolore, somministrare agenti antinfiammatori e analgesici (ad esempio, desametasone e ketoprofene, 5 mg / kg ciascuno, i.p.). Monitorare regolarmente i topi per l’infezione. Se un’infezione è confermata, somministrare un farmaco antimicrobico (ad esempio, 10 % di enrofloxacina, 1,7 μL/ml) nell’acqua potabile fino all’eliminazione dell’infezione (in genere meno di 4 settimane). 3. Fare un film AAV su pellicola trasparente usando una soluzione di fibroina NOTA: il passaggio 3 è facoltativo. Preparare la soluzione di fibroina dai bozzoli del baco da seta seguendo un metodo precedentemente pubblicato37.In breve, far bollire i normali bozzoli di bachi da seta disponibili in commercio (5 g, vedi Tabella dei materiali) in soluzione di carbonato di sodio (0,02 M, 2 L). Lavare i bozzoli in acqua ultrapura e asciugarli durante la notte. Sciogliere i bozzoli essiccati in una soluzione di bromuro di litio (9,3 M, 20% p/v di fibroina) riscaldando in forno a 60 °C per 4 ore. Dializzare la soluzione di bozzolo disciolto, centrifugare (due volte a 12.700 x g, a 4 °C per 20 min)37 e raccogliere il surnatante. Preparare il film di fibroina-AAV seguendo i passaggi seguenti.Mescolare le soluzioni di fibroina e AAV20 in un rapporto 1:4 in una piccola provetta utilizzando una micropipetta. Far cadere un’aliquota della soluzione mista di fibroina-AAV sull’involucro di plastica per la finestra cranica e asciugarla per almeno 3 ore.NOTA: Per l’espressione in un’area di 3 mm di diametro, applicare una goccia da 5 μL di soluzione di fibroina-AAV. Questo rapporto determina la quantità di soluzione per una determinata area. Dopo l’asciugatura, tagliare l’involucro di plastica nella dimensione richiesta per la finestra (ad esempio, 10 x 15 mm) e posizionarlo sulla superficie del cervello. Quindi, seguire il metodo sopra menzionato dal passaggio 2.8.1 in poi.NOTA: Prima di posizionare l’involucro sulla superficie del cervello, rimuovere l’ACSF sulla superficie del cervello il più possibile. Questo perché l’ACSF dovrebbe dissolvere il film di fibroina-AAV e ridurre la concentrazione di particelle AAV. Attendere circa 2-4 settimane dopo aver creato la finestra trattata con AAV fino a quando i GECI non sono sufficientemente espressi. Durante questo processo, controllare regolarmente le condizioni dei topi e delle finestre. 4. Imaging e analisi del calcio NOTA: Per i dettagli sull’imaging e l’analisi, vedere i rapporti pubblicati in precedenza 1,2,38. Eseguire l’imaging a campo ampio seguendo i passaggi seguenti.Immobilizzare il mouse utilizzando un dispositivo di fissaggio della testa sotto un macroscopio a fluorescenza con lente tandem (vedere Tabella dei materiali). Illuminare la corteccia cerebrale dei topi con la luce di eccitazione proveniente da una sorgente luminosa a LED da 465 nm attraverso un filtro di eccitazione, uno specchio dicroico e una lente obiettiva. Raccogliere le immagini di fluorescenza della corteccia cerebrale da una telecamera CCD attraverso una lente obiettiva (1,0x), uno specchio dicroico, un filtro di emissione e una lente di imaging (2,0x). La combinazione di queste lenti offre un ingrandimento totale di circa 0,5x. Acquisire immagini a una frequenza di campionamento di 50 Hz. Dopo l’acquisizione dei dati, analizzare le immagini utilizzando il software ImageJ. Selezionare manualmente la regione di interesse (ROI). Calcola la variazione di fluorescenza in ogni ROI come ΔF/F = (Ft – F0) / F0, dove Ft è il valore di fluorescenza grezzo di ciascun fotogramma e F0 è il valore medio di fluorescenza ottenuto da un’immagine media di tutti i fotogrammi.NOTA: un programma macro per ImageJ viene depositato su GitHub (https://github.com/Satoshi-Manita/ImageJ-macro), che calcola le immagini ΔF/F dai dati di imaging del calcio. Eseguire l’imaging a due fotoni seguendo i passaggi seguenti.Immobilizzare il mouse sotto un microscopio a due fotoni usando un dispositivo di fissaggio della testa. Identificare l’area da riprendere utilizzando il microscopio in modalità campo luminoso con un obiettivo a basso ingrandimento (5x). Passa all’imaging a due fotoni. Utilizzare un obiettivo ad alto ingrandimento (16x o 25x) e illuminare il laser per l’eccitazione a due fotoni.NOTA: Lck-GCaMP6f22 verde e XCaMP-R36 rosso sono stati eccitati da un laser ultraveloce a lunghezze d’onda di eccitazione rispettivamente di 920 nm e 1070 nm. Acquisire immagini a fluorescenza a 30 Hz. Dopo l’acquisizione dei dati, correggere gli artefatti di movimento tramite la funzione di registrazione del software suite2p39. Ottieni ROI e ΔF/F dalle immagini utilizzando lo stesso metodo per l’imaging a campo ampio. Tracciare i dati usando python con le seguenti librerie: NumPy, Matplotlib e Pandas (vedere Tabella dei materiali).

Representative Results

Valutazione di una grande finestra cranica realizzata con i metodi di avvolgimento PVDCImmediatamente dopo l’intervento chirurgico, il successo o il fallimento possono essere controllati a colpo d’occhio dalle condizioni della superficie corticale, come sanguinamento e cambiamento di colore a causa di danni o ischemia. Molto tempo dopo l’intervento chirurgico, la superficie corticale può essere coperta da una membrana bianca opaca a causa di un’infezione, o il sangue può coprire la finestra a causa di sanguinamento (Figura 2G). In questi casi, la corteccia potrebbe non essere in buone condizioni e l’imaging potrebbe non essere possibile. Questi potrebbero essere causati da involucri parzialmente recisi o da una fissazione insufficiente dell’involucro da parte dell’adesivo. Se l’infezione viene ripetutamente osservata, può essere efficace applicare antibiotici, ad esempio gentamicina solfato (10 μL, 50 mg / ml), sulla superficie del cervello al posizionamento della finestra. La rigenerazione delle meningi o delle ossa si osserva anche quando lo spazio verticale tra la superficie corticale e l’involucro è grande. Per evitare ciò, applicare l’involucro il più strettamente possibile alla superficie del cervello durante la preparazione della finestra è fondamentale. Ciò può essere ottenuto posizionando un involucro di plastica sulla superficie del cervello e aspirando quanto più ACSF possibile. In assenza di ACSF, può essere fatto semplicemente posizionando l’involucro di plastica sulla superficie del cervello. Il cervello e i vasi sanguigni sono determinati per essere intatti dal fatto che il colore del cervello non è scolorito e i vasi sanguigni non sono recisi. La longevità della finestra dipende in gran parte dalla qualità dell’intervento chirurgico. Quando la condizione è buona, non vi è alcun segno di infezione, sanguinamento o rigenerazione più di 1 mese dopo l’intervento chirurgico (Figura 2F e Figura 3B). In 8 topi su 10, la finestra potrebbe essere mantenuta libera fino a 10 settimane o più. Le finestre in due dei topi non potevano essere mantenute correttamente a causa di infezioni o sanguinamento. Sebbene la grande finestra possa essere soggetta a sollecitazioni meccaniche o urti, non sono state osservate finestre rotte o incrinate. Per valutare la qualità di imaging della nuova finestra cranica con l’involucro, il silicone e il vetro, la funzione di diffusione puntuale è stata confrontata sotto la nuova finestra con quella sotto la finestra di vetro convenzionale mediante imaging di perle fluorescenti da 0,1 μm in agar (vedi file supplementare 1). I risultati non hanno mostrato alcuna differenza nella larghezza completa a metà massimo (FWHM) per entrambe le condizioni. [Asse X (μm): solo vetro, 1,99 ± 0,07, avvolgimento, 1,76 ± 0,13, asse Y (μm): solo vetro, 2,11 ± 0,27, avvolgimento, 1,90 ± 0,15, asse Z (μm): solo vetro, 25,29 ± 0,71, avvolgimento, 26,64 ± 1,02, N = 7 perline, p > 0,05, test U di Mann-Whitney, figura supplementare 2A,B]. Pertanto, i nuovi elementi aggiunti (involucro e silicone) non hanno deteriorato la qualità dell’immagine. Gli artefatti vibrazionali causati dalla respirazione, dal battito cardiaco e dal movimento del corpo sono presenti nell’imaging a campo largo e a due fotoni. Per determinare quanto vibra la nuova finestra cranica, una piccola particella fluorescente è stata selezionata dai dati di imaging a due fotoni in vivo e ha esaminato quanto la sua immagine si è mossa durante 60 s. Si è constatato che la deviazione standard del centroide di quella particella fluorescente era di circa 0,3 μm, che è paragonabile a quella sotto una finestra di vetro convenzionale (figura supplementare 2C). Ciò indica che, poiché il cervello era tenuto giù da un tappo di silicone trasparente e da un vetro di copertura, le vibrazioni erano paragonabili a quelle osservate nelle finestre più piccole convenzionali e la registrazione delle immagini offline era sufficiente per eliminare gli artefatti di vibrazione. Nell’imaging del calcio ad ampio campo, l’attività corticale potrebbe essere osservata propagarsi attraverso la corteccia indotta dalla stimolazione sensoriale (Figura 3A-D, K-N). L’imaging a due fotoni ha permesso l’osservazione di immagini di fluorescenza a singola cellula specifiche per neuroni e cellule gliali (Figura 3E,O). I cambiamenti di fluorescenza indotti dalla stimolazione sensoriale potrebbero essere osservati nelle singole cellule (Figura 3E-J,O-T). Espressione di indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) in un’ampia area della corteccia cerebrale utilizzando l’involucro PVDC e AAVL’involucro PVDC per la finestra potrebbe essere applicato per esprimere proteine funzionali in un’ampia area della corteccia. Ciò si ottiene utilizzando AAV e fibroina, una proteina componente dei bozzoli del baco da seta che è stata ampiamente applicata come biomateriali37. Uno studio precedente ha dimostrato che la fibroina potrebbe essere mescolata con AAV, formando film impiantati nel cervello per esprimere proteine funzionali come opsine fotoattivabili o GECI36. Nel presente studio, AAV che esprime GECI e fibroina sono stati miscelati e asciugati sull’involucro e l’involucro rivestito di AAV è stato utilizzato per la finestra cranica. Ciò ha portato all’espressione di GECI su un’ampia area della corteccia 2-4 settimane dopo l’intervento chirurgico (Figura 3K-M). Poiché la finestra era grande, è possibile visualizzare diverse aree corticali dello stesso mouse (Figura 3M-T). Per confermare l’efficienza di espressione di questo metodo, il numero di cellule che esprimono GECI è stato contato nel cervello fisso (Figura supplementare 2D). È stato riscontrato che l’attuale strategia utilizzando l’involucro con fibroina-AAV ha portato all’espressione di GECI con un’efficienza di circa il 20% sia negli strati superficiali che in quelli più profondi (L2/3: 20,78%, cellula che esprime XCaMP-R: 32 cellule, DAPI: 154 posizioni, L5: 20,08%, cellula che esprime XCaMP-R: 51 cellule, DAPI: 254 posizioni). Pertanto, questo metodo ha espresso GECI nelle cellule non solo negli strati superficiali ma anche negli strati più profondi. Figura 1: Diagramma concettuale della grande finestra cranica. (A) A sinistra, disegno schematico della nuova finestra cranica. È più grande della finestra convenzionale (3 mm di diametro). A destra, vista in sezione trasversale. Il metodo per realizzare una grande finestra cranica utilizza un involucro alimentare, un elastomero siliconico trasparente e un vetro di copertura, consentendo l’imaging a campo largo e a due fotoni dallo stesso mouse. (B) Procedura di fabbricazione della finestra cranica: (a) Rimozione ossea. b) Rimozione dell’ACSF sotto l’involucro. (c) Aderenza dell’involucro alla superficie cerebrale rimuovendo ACSF. d) Tagliare l’involucro in eccesso. e) Applicazione di silicone trasparente. f) Fissaggio di vetri di copertura. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 2: Panoramica della chirurgia della finestra cranica . (A) Materiali e attrezzature necessari per la finestra cranica. a) Pellicola per avvolgere il cloruro di polivinilidene (PVDC). b) Un dosatore di elastomero siliconico trasparente con punta di miscelazione. c) Vetro di copertura. d) Silicone trasparente posto tra due pezzi del vetro di copertura. (B) Fotografia della pelle della testa di topo incisa per esporre il cranio. Il topo è stato anestetizzato e la testa del topo è stata immobilizzata usando barre auricolari. La testa è stata poi depelosa, trattata con analgesia locale, e la pelle è stata incisa. (C) Fotografia dopo l’installazione di una piastra di testa. Una piastra di testa (realizzata in resina da una stampante 3D) è stata attaccata alla testa del mouse con cemento dentale. (D) Fotografia di una finestra cranica. La finestra cranica è stata creata nella corteccia dell’emisfero destro del cervello del topo. La dura madre è stata rimossa e l’involucro è stato incollato sul posto. (E) Una foto della finestra fatta dell’involucro con il silicone trasparente e il vetro di copertura in cima. (F) Un tipico esempio di finestra di successo (emisfero destro, 7 settimane dopo l’intervento chirurgico). (G) Esempio di finestra fallita (entrambi gli emisferi, 5 settimane dopo l’intervento chirurgico). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 3: L’ampia finestra consente l’imaging del calcio a campo largo e a due fotoni dallo stesso mouse. (A) L’imaging del calcio è stato eseguito in un topo transgenico che esprime GECI ancorato alla membrana (Lck-GCaMP6f) negli astrociti40. (B) A sinistra, è stata creata una grande finestra con pellicola trasparente, silicone trasparente e vetro di copertura. L’imaging a grande campo è stato eseguito attraverso questa finestra. A destra, una foto è stata scattata 79 giorni dopo l’installazione della finestra cranica. (C) Quando la stimolazione del soffio d’aria è stata applicata ai baffi controlaterali, sono stati osservati cambiamenti di fluorescenza. (D) È stato tracciato il corso temporale del cambiamento di fluorescenza nella corteccia somatosensoriale (quadrato rosso in C). Le barre rosse e blu indicano rispettivamente i tempi di soffio d’aria e i tempi “prima”, “durante” e “dopo” in (C). (E) Il campo visivo (FOV 1 in C) dell’imaging del calcio a due fotoni. Poiché GCaMP6f è stato espresso per localizzare la membrana, le regioni di interesse (quadrati bianchi) sono state posizionate manualmente per rilevare la risposta locale nei processi astrocitari. (F) Vengono tracciate le variazioni di fluorescenza nei quadrati colorati in (E). (G) Vengono tracciate le variazioni di fluorescenza in tutti i quadrati di (E). Gli assi orizzontale e verticale indicano rispettivamente il tempo e il numero di celle. (H-J) Vengono mostrati i dati per FOV 2 (nella corteccia visiva) in (C). Il FOV 2 è stato ripreso dopo l’imaging nel FOV 1. (K) Red GECI, XCaMP-R, è stato espresso nei neuroni con il metodo della fibroina-AAV nel topo wild-type. (L) Fotografia scattata due settimane dopo l’intervento chirurgico in cui la finestra è stata creata utilizzando la pellicola di fibroina. (M) Su questo topo è stata eseguita l’imaging a largo campo del calcio. (N) Il cambiamento di fluorescenza evocato dalla stimolazione dei baffi è stato tracciato dal sito più prominente (corteccia somatosensoriale, quadrato rosso in (M)). Le linee rosse e blu indicano rispettivamente la temporizzazione del soffio d’aria e la temporizzazione “prima” e “durante” in (M). (O) Campo visivo (corteccia somatosensoriale, FOV 1 in (M)) dell’imaging di calcio a due fotoni a 300 μm di profondità. I ROI sono stati posizionati manualmente a livello di somata neuronale. (P) Vengono tracciate le variazioni di fluorescenza nei quadrati colorati in (O). (Q) Le variazioni di fluorescenza in tutti i quadrati di (O) sono tracciate a colori. (R-T) Vengono mostrati i dati per FOV 2 in (M) situato nella corteccia parietale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura supplementare 1: Suggerimenti per bisturi. La punta del nuovo bisturi (in alto) rispetto al bisturi utilizzato per tagliare il cranio con una punta smussata (in basso). Clicca qui per scaricare questo file. Figura supplementare 2: Validazione della nuova finestra cranica e del metodo di espressione della fibroina-AAV. (A) Profilo di intensità di fluorescenza delle sfere fluorescenti da 0,1 μm in agar. La riga superiore mostra i dati di una condizione in cui solo il vetro di copertura è stato posizionato su perle fluorescenti mescolate in agar, e la riga inferiore mostra i dati di una condizione in cui sono stati posizionati involucro, silicone trasparente e vetro di copertura. Le tracce grigie mostrano l’adattamento gaussiano al profilo di intensità della fluorescenza per ogni perla, e le tracce rosse mostrano i loro valori medi (n = 7). (B) Riepilogo dei dati di cui alla lettera A). Ogni grafico mostra l’intera larghezza a metà massimo (FWHM) della funzione di diffusione dei punti sull’asse XYZ. Il grafico grigio mostra i dati per ogni tallone e il rosso mostra il loro errore medio e standard. (C) Dai 2.000 fotogrammi (registrazione di 60 s) di dati di imaging in vivo , è stata selezionata una piccola particella fluorescente ed è stata esaminata quanto l’immagine si muoveva durante gli anni ’60. L’immagine fluorescente al centro rappresenta la media di 2.000 fotogrammi. Le immagini sono state proiettate facendo la media nelle direzioni degli assi X e Y. Gli istogrammi mostrano la distribuzione del centroide in ogni fotogramma. Le deviazioni standard del centroide erano X: 0,36 e Y: 0,315 μm. (D) Esempio di espressione di GECI con il metodo della fibroina-AAV. A sinistra: una fetta di corteccia cerebrale ha applicato il metodo di espressione della fibroina-AAV. Il rosso e il blu indicano la fluorescenza da XCaMP-R e DAPI, rispettivamente; XCaMP-R è stato espresso non solo nelle cellule di strato 2/3 ma anche nelle cellule di strato 5. Al centro e a destra. Viste ingrandite degli strati 2/3 e 5 nella figura sinistra (quadrati ciano), rispettivamente. Clicca qui per scaricare questo file. File supplementare 1: (A) Efficienza di espressione dell’involucro con il metodo del film di fibroina-AAV e (B) Valutazione della funzione di diffusione del punto durante l’imaging a due fotoni. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Questo articolo presenta un metodo economico per creare una grande finestra cranica utilizzando un involucro di plastica PVDC, silicone trasparente e vetro di copertura. Utilizzando questo metodo, abbiamo dimostrato che l’imaging del calcio ad ampio campo potrebbe essere eseguito su una vasta area della corteccia cerebrale. L’imaging del calcio a due fotoni può essere eseguito da diverse regioni corticali nello stesso topo che è stato sottoposto a imaging a campo ampio. Inoltre, è stato dimostrato che un film di fibroina-AAV sull’involucro di plastica utilizzato per la finestra potrebbe esprimere GECI su una vasta area della corteccia.

Passaggi critici
È importante evitare infezioni e danni al cervello quando si realizzano finestre craniche con un involucro di plastica. In queste condizioni, l’attività neurale e gliale non può essere osservata e l’imaging di aree più profonde è impossibile. La lesione ai vasi sanguigni provoca anche sanguinamento, rendendo impossibile l’imaging a causa del sangue. Per evitare l’infezione, rendere la superficie del cervello e l’involucro attaccato il più strettamente possibile è fondamentale aspirando l’ACSF. La somministrazione di mannitolo è importante per evitare danni al cervello e ai vasi sanguigni prevenendo l’aumento della pressione cerebrale durante l’intervento chirurgico. Questo mantiene lo spazio tra la superficie del cervello e la dura madre e impedisce al cervello e ai vasi sanguigni di essere toccati durante la rimozione del cranio e della dura madre. Un microscopio stereo ad alto ingrandimento e pinzette con punte affilate sono anche efficaci per un intervento chirurgico accurato.

Nel metodo fibroina-AAV, è essenziale utilizzare bozzoli di baco da seta di carne, non congelare la soluzione di fibroina, asciugare sufficientemente la soluzione di fibroina-AAV e applicare un volume sufficiente di soluzione (5 μL per 3 mm di diametro). Quando venivano usati bozzoli più vecchi, l’efficienza di espressione era inferiore. Questo perché la fibroina dei vecchi bozzoli può essere denaturata facilmente. Quando la soluzione di fibroina è stata congelata a -80 °C e scongelata al momento dell’uso, l’efficienza di espressione era scarsa. Ciò può essere dovuto alla denaturazione della proteina dovuta al congelamento e allo scongelamento. Poiché le soluzioni di fibroina conservate a 4 °C possono essere efficacemente utilizzate fino alla gelificazione, si raccomanda di conservare le soluzioni di fibroina in frigorifero e purificate dai bozzoli dopo la gelificazione. La soluzione di fibroina-AAV deve essere essiccata per almeno 3 ore, poiché l’espressione è scarsa dopo meno di 3 ore. Infine, l’area di espressione dipende dalla quantità di soluzione di fibroina-AAV utilizzata. Nell’esempio nella figura 3M, la quantità era piccola (5 μL); pertanto, il film di fibroina-AAV copriva solo la metà superiore della finestra, con conseguente espressione non uniforme sopra la finestra. Se viene utilizzata una quantità sufficiente di fibroina-AAV, l’espressione sarà uniforme su tutta la finestra.

Modifiche della tecnica
La nuova tecnica della finestra cranica consente di esaminare l’attività macroscopica dei circuiti corticali e la loro attività sottostante a livello di singola cellula nello stesso topo. Pertanto, il metodo può essere applicato a una varietà di studi neuroscientifici. Ad esempio, può essere utilizzato per osservare l’attività corticale durante i compiti decisionali, l’apprendimento motorio e nei modelli murini di lesioni cerebrali e malattie. Crediamo anche che il metodo possa essere applicato non solo ai roditori ma anche ai primati non umani.

Questo articolo dimostra che la grande finestra cranica è efficace per l’imaging di topi transgenici e topi iniettati con AAV che esprimono proteine funzionali. In particolare, è dimostrato che il film di fibroina-AAV sull’involucro è molto più facile di un metodo di iniezione AAV convenzionale per esprimere GECI attraverso l’ampia area della corteccia. Utilizzando una miscela di due AAV che codificano GECI di diversi colori⁴¹, la correlazione tra l’attività del neurone e delle cellule gliali può essere visualizzata simultaneamente su un’ampia area della corteccia. Inoltre, il metodo del film di fibroina-AAV può essere applicato anche ad altri biosensori geneticamente codificati 42,43,44,45,46,47.

La finestra cranica più grande, che può visualizzare entrambi gli emisferi, è anche possibile. Microscopi a due fotoni con un campo visivo molto più ampio (~25 mm²) sono stati recentemente sviluppati 25,26,27,28,29. La combinazione di questa tecnica di imaging a due fotoni con l’imaging a campo largo a un fotone utilizzando l’ampia finestra cranica qui descritta ci permetterà di esaminare la relazione tra l’attività della popolazione e l’attività di una singola cellula da scale senza precedenti.

Limitazioni
L’involucro alimentare non consente il passaggio di alcuna sostanza. Ciò rende il metodo difficile da utilizzare per esperimenti farmacologici. È anche difficile rimuovere l’involucro, rendendo impossibile inserire una pipetta di vetro o un elettrodo. Pertanto, è difficile implementare esperimenti combinati con altri metodi come l’imaging simultaneo del calcio e le registrazioni elettrofisiologiche e la somministrazione locale di farmaci utilizzando una pipetta di vetro. Una possibile soluzione per queste limitazioni è quella di utilizzare l’involucro e la finestra di vetro con un foro. Ciò consente l’accesso al cervello tramite una pipetta di vetro o un elettrodo di registrazione mantenendo sterile la finestra cranica per un lungo periodo⁴⁸.

Materials

4% paraformaldehyde phosphate buffer solution	NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan	TritonX	Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method
50 mL beaker
Acquisition software	Brain vision	BV_Ana	For wide-field calcium imaging of GCaMP6f
Acquisition software	Hamamatsu photonics	High speed recording software: HSR	For wide-field calcium imaging of XCaMP-R
Acquisition software	Vibrio Technologies	scanImage	For two-photon calcium imaging
ACSF (artificial cerebrospinal fluid)			150 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH = 7.4 with 1M NaOH
ACSF aspiration needle
Adeno-associated virus	VectorBuilder	custom-made	AAV-DJ/8-Syn1-XCaMP-R
Adhesives for biological use	Daiichi Sankyo	Aron Alpha-A
Anesthesia machine	Shinano seisakusho	SN-487
Anesthetic	Kyoritsu Seiyaku Corporation	pentobarbital	Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method
Auxiliary ear bar	Narishige	EB-5N
CCD camera	Brain vision	MiCAM02-HR	For wide-field calcium imaging of GCaMP6f
Clear vinyl polysiloxane	GC	Exaclear
CMOS camera	Hamamatsu photonics	ORCA-spark	For wide-field calcium imaging of XCaMP-R
Cotton swab
Cover glass	Matsunami	18 x 18 NO.1	Size: 18 x 18 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm, Borosilicate glass
DAPI	Thermo Fisher	D1306	Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method
Ddialysis cassette	3.5K MWCO, Slide-A-Lyzer	ThermoFisher
Dental adhesive resin cement	SUN MEDICAL	Super-Bond
Dental drill	Nakanishi	VOLVERE Vmax
Digital scale	Dretec	KS-243
Filters	Brain vision		EM: BP466/40-25, DM: DM506, EX: BP520/36-50
Filters	Olympus		U-MRFPHQ, EM: BP535-555HQ, DM: DM565HQ, Ex: BA570-625HQ
Fluorescence microscope	Keyence	BZ-X810	Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method
Fluorescent beads	Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres	0.1 µm	Evaluation of the point spread function under the conventional and the new cranial windows in two-photon imaging
Forceps	FST	No. 11252-20	thin-tipped, for removal of dura mater
Forceps	KFI	K-7, No.J 18-8	for general use
Gelatin for hemostasis	Johnson & Johnson	Spongostan
Gentamicin sulfate	Iwaki seiyaku
Glass pipette	custom-made
Hair remover	Reckitt Japan	Veet
Head fixing device	custom-made		Craniotomy for Cortical Voltage-sensitive Dye Imaging in Mice. Suzuki, T., and Murayama, M. Bio-protocol 2016 6:e1722.
Head plate	custom-made		aluminum or resin, size: 40 x 25 mm, thickness: 1.5 mm or 2 mm, hole in the center: 15 x 10 mm (head_plate_06 v3.f3d)
Heating pad
Image processing software (for calcium imaging data analysis)		ImageJ	https://imagej.net
Isoflurane	Pfizer
Light source	Hayashi-repic	LA-HDF108AA
Light source	Brain vision	LEX2-LZ4-B	For wide-field calcium imaging of GCaMP6f
Light source	Olympus	U-HGLGPS	For wide-field calcium imaging of XCaMP-R
Mannitol solution (15% with saline)	Sigma-Aldrich (Merck)	M4125
Micro curette	FST	No. 10080-05
Microscope	Brain vision		For wide-field calcium imaging of GCaMP6f
Microscope	Olympus	MVX10	For wide-field calcium imaging of XCaMP-R
Microscope	Sutter Instruments	MOM	For two-photon calcium imaging
Microslicer	Dosaka EM	DTK-1000N	Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method
Mixing tip	GC
Needle (30 G)
Polyethylens spoids	AS ONE	1-4656-01
Polyvinylidene chloride (PVDC) film	Asahi Kasei	Asahi Wrap (or Saran Wrap)
Povidone-iodine	Mundipharma	Isodine
Python libralies		NumPy	package for scientific computing, https://numpy.org/doc/stable/index.html#
		Matplotlib	library for visualizations, https://matplotlib.org/stable/index.html#
		pandas	data analysis and manipulation tool, https://pandas.pydata.org
Scalpel	Kai	No. 11
Shaver for animal
Silicone dispensers	GC
Silkworm cocoon	Satoyama Craft News		https://sato-yama.jp/
Stereomicroscope	LEICA	MZ6	objective lens: 0.63x, eyepiece: 25x
Surfactant	NACALAI TESQUE	TritonX	Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method
Surgical Scissors	FST	No. 91460-11
Syringe for mannitol injection	Terumo	1mL
Transdermal anesthetic	AstraZeneca	Lidocaine
Transgenic mice used for calcium imaging of astrocytes			The mice were obtained by the following method. AldH1l1-CreERT2 mice: B6N.FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J (The Jackson laboratory, strain #: 031008) Tamoxifen-inducible Cre recombinase expression directed at high levels to the vast majority of astrocytes Flx-Lck-GCaMP6f mice: C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-GCaMP6f)Khak]/J (The Jackson laboratory, strain #: 029626) Cre-dependent expression of a plasma membrane-targeted GCaMP6f. A mouse born from crossbreeding these mice were treated with tamoxifen (20 mg/mL) for 5 days (0.05 mL/10g bw, i.p.) to express GCaMP6f.
Tunable ultrafast lasers	Spectra-Physics	InSight X3	For two-photon calcium imaging
Waterproof film	Nichiban	BFR5
Wild-type mice	Japan SLC	C57BL/6J	Male and femalek, >4 weeks old