Kwantificering van immunostained Caspase-9 in retinaal weefsel
Summary
Hier wordt een gedetailleerd immunohistochemisch protocol gepresenteerd om functioneel relevante caspasen in complexe weefsels te identificeren, valideren en targeten.
Abstract
Van de familie van caspasen is bekend dat ze vele cellulaire routes bemiddelen voorbij celdood, waaronder celdifferentiatie, axonale pathfinding en proliferatie. Sinds de identificatie van de familie van celdoodproteasen is er gezocht naar hulpmiddelen om de functie van specifieke familieleden in ontwikkelings-, gezondheids- en ziektetoestanden te identificeren en uit te breiden. Veel van de momenteel in de handel verkrijgbare caspase-tools die veel worden gebruikt, zijn echter niet specifiek voor de beoogde caspase. In dit rapport schetsen we de aanpak die we hebben gebruikt om caspase-9 in het zenuwstelsel te identificeren, valideren en targeten met behulp van een nieuwe remmer en genetische benaderingen met immunohistochemische uitlezingen. Specifiek gebruikten we het retinale neuronale weefsel als een model om de aanwezigheid en functie van caspasen te identificeren en te valideren. Deze benadering maakt het mogelijk om celtypespecifieke apoptotische en niet-apoptotische caspase-9-functies te ondervragen en kan worden toegepast op andere complexe weefsels en caspasen van belang. Het begrijpen van de functies van caspasen kan helpen om de huidige kennis in celbiologie uit te breiden, en kan ook voordelig zijn om potentiële therapeutische doelen te identificeren vanwege hun betrokkenheid bij ziekte.
Introduction
De caspasen zijn een familie van proteasen die ontwikkelingsceldood, immuunresponsen en afwijkende celdood bij ziekte 1,2 reguleren. Hoewel het bekend is dat leden van de caspase-familie worden geïnduceerd in een verscheidenheid aan neurodegeneratieve ziekten, is het moeilijker om te begrijpen welke caspase de ziektepathologie aandrijft3. Dergelijke studies vereisen hulpmiddelen om de functie van individuele caspase-familieleden te identificeren, te karakteriseren en te valideren. Het ontleden van de relevante individuele caspasen is belangrijk, zowel vanuit een mechanistisch als een therapeutisch standpunt, omdat de literatuur meerdere studies bevat die bewijs leveren voor de verschillende rollen van caspasen 4,5. Dus als het doel is om een caspase in een ziekte te richten voor een therapeutisch voordeel, is het van cruciaal belang om specifieke targeting van het relevante familielid (en) te hebben. Traditionele technieken om caspaseniveaus in weefsel te detecteren omvatten western blotting en enzymatische en fluorometrische benaderingen 3,6. Geen van deze maatregelen maakt echter celspecifieke detectie van caspaseniveaus mogelijk en in sommige scenario’s kunnen gesplitste caspasen vaak niet worden gedetecteerd door traditionele eiwitanalysemaatregelen. Het is bekend dat caspasen verschillende apoptotische en niet-apoptotische rollen kunnen spelen in hetzelfde weefsel7, daarom is een zorgvuldige karakterisering van celspecifieke caspaseniveaus nodig voor een nauwkeurig begrip van ontwikkelings- en ziekteroutes.
Deze studie toont caspase activatie en functie in een model van neurovasculaire hypoxie-ischemie – retinale ader occlusie (RVO)7,8. In een complex weefsel zoals het netvlies zijn er meerdere celtypen die kunnen worden beïnvloed door de hypoxie-ischemie geïnduceerd in RVO, waaronder gliacellen, neuronen en vasculatuur7. In het netvlies van de volwassen muis is er zeer weinig expressie van caspasen zichtbaar in gezond weefsel, zoals gemeten door immunohistochemie (IHC)7, maar dat is niet het geval tijdens ontwikkeling9 of in modellen van retinale ziekte10,11. IHC is een techniek die goed is ingeburgerd in biomedisch onderzoek en heeft validatie van ziekte en pathologische doelen, identificatie van nieuwe rollen door ruimtelijke lokalisatie en kwantificering van eiwitten mogelijk gemaakt. In gevallen waarin gesplitste caspaseproducten niet kunnen worden gedetecteerd door western blot of fluorometrische analyse, noch de specifieke cellocatie van verschillende caspasen of ondervraging van caspase-signaleringsroutes door lokalisatie, moet IHC worden gebruikt.
Om de caspase(s) functioneel relevant in RVO te bepalen, werd IHC gebruikt met gevalideerde antilichamen voor caspasen en cellulaire markers. De eerdere studies uitgevoerd in het laboratorium toonden aan dat caspase-9 snel werd geactiveerd in een model van ischemische beroerte en remming van caspase-9 met een zeer specifieke remmer beschermd tegen neuronale disfunctie en overlijden12. Omdat het netvlies deel uitmaakt van het centrale zenuwstelsel (CZS), dient het als een modelsysteem om de rol van caspase-9 bij neurovasculaire verwondingen te onderzoeken en verder te onderzoeken13. Hiertoe werd het muismodel van RVO gebruikt om de celspecifieke locatie en distributie van caspase-9 en de implicatie ervan in neurovasculair letsel te bestuderen. RVO is een veel voorkomende oorzaak van blindheid bij werkende volwassenen die het gevolg is van vaatletsel14. Het bleek dat caspase-9 op een niet-apoptotische manier tot expressie kwam in endotheelcellen, maar niet in neuronen.
Als weefsel heeft het netvlies het voordeel dat het wordt gevisualiseerd als een flatmount, die waardering van de vasculaire netwerken mogelijk maakt, of als doorsneden, die de neuronale retinale lagen benadrukken. Kwantificering van caspase-eiwitexpressie in doorsneden biedt context, met betrekking tot welke caspase potentieel kritisch is in retinale neuronale connectiviteit en visiefunctie door de lokalisatie van de caspase (s) in het netvlies te identificeren. Na identificatie en validatie wordt targeting van de caspase van belang bereikt met behulp van induceerbare celspecifieke deletie van de geïdentificeerde caspase. Voor mogelijke therapeutische onderzoeken werd de relevantie van de caspasen van belang getest met behulp van specifieke hulpmiddelen om de geactiveerde caspase te remmen. Voor caspase-9 werd een celpermeant zeer selectieve remmer 7,15, Pen1-XBIR3 gebruikt. Voor dit rapport werden 2 maanden oude, mannelijke C57BL/6J stam en tamoxifen-induceerbare endotheel caspase-9 knockout (iEC Casp9KO) stam met een C57BL/6J achtergrond gebruikt. Deze dieren werden blootgesteld aan het muismodel van RVO en C57BL/6J werden behandeld met de caspase-9 selectieve remmer, Pen1-XBir3. De beschreven methodologie kan worden toegepast op andere ziektemodellen in het centrale en perifere systeem 7,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Caspasen zijn een meergedelige familie van proteasen die het best bestudeerd kunnen worden voor hun rol bij celdood en ontsteking; meer recent zijn echter verschillende niet-doodsfuncties ontdekt voor sommige familieleden 4,5. Veel van ons begrip van de caspase-functie is afgeleid van werk in celkweek en van inferentiële gegevens van menselijke ziekten. Hoewel het wordt gewaardeerd dat er afwijkende inductie, activering of inactivatie van caspasen bij ziekte is,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) subsidie DGE – 1644869 en het National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) van de National Institutes of Health (NIH), awardnummer F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (aan CKCO), het National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (aan AMP), het National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 naar CMT) en het Department of Defense Army/Air Force (DURIP naar CMT).
Materials
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
| Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | open source | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Forcep | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Perfusion pump | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
- Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 82, 79-85 (2018).
- Troy, C. M., Jean, Y. Y. Caspases: therapeutic targets in neurologic disease. Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).
- Avrutsky, M. I., Troy, C. M. Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease. Frontiers in Pharmacology. 12, 1728 (2021).
- Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147 (4), 742-758 (2011).
- Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. Y. Regulation of caspases in the nervous system: implications for functions in health and disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 99, 265-305 (2011).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Colon Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments. (174), e62980 (2021).
- Tisch, N., et al. Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development. The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).
- Chi, W., et al. HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma. Journal of Neuroinflammation. 12, 137 (2015).
- Thomas, C. N., et al. Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).
- Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death & Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).
- Kuida, K., et al. Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9. Cell. 94 (3), 325-337 (1998).
- Troy, C. M., et al. Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation. Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).
