Quantifizierung von immungefärbtem Caspase-9 im Netzhautgewebe
Summary
Hier wird ein detailliertes immunhistochemisches Protokoll vorgestellt, um funktionell relevante Caspasen in komplexen Geweben zu identifizieren, zu validieren und gezielt anzugehen.
Abstract
Es ist bekannt, dass die Familie der Caspasen viele zelluläre Wege über den Zelltod hinaus vermittelt, einschließlich Zelldifferenzierung, axonaler Wegfindung und Proliferation. Seit der Identifizierung der Familie der Zelltodproteasen wurde nach Werkzeugen gesucht, um die Funktion bestimmter Familienmitglieder in Entwicklungs-, Gesundheits- und Krankheitszuständen zu identifizieren und zu erweitern. Viele der derzeit kommerziell erhältlichen Caspase-Tools, die weit verbreitet sind, sind jedoch nicht spezifisch für die angestrebte Caspase. In diesem Bericht beschreiben wir den Ansatz, den wir verwendet haben, um Caspase-9 im Nervensystem unter Verwendung eines neuartigen Inhibitors und genetischer Ansätze mit immunhistochemischen Auslesungen zu identifizieren, zu validieren und anzugreifen. Insbesondere haben wir das retinale neuronale Gewebe als Modell verwendet, um das Vorhandensein und die Funktion von Caspasen zu identifizieren und zu validieren. Dieser Ansatz ermöglicht die Abfrage zelltypspezifischer apoptotischer und nicht-apoptotischer Caspase-9-Funktionen und kann auf andere komplexe Gewebe und Caspasen von Interesse angewendet werden. Das Verständnis der Funktionen von Caspasen kann dazu beitragen, das aktuelle Wissen in der Zellbiologie zu erweitern, und kann auch vorteilhaft sein, um potenzielle therapeutische Ziele aufgrund ihrer Beteiligung an Krankheiten zu identifizieren.
Introduction
Die Caspasen sind eine Familie von Proteasen, die den Entwicklungszelltod, die Immunantwort und den aberranten Zelltod bei Krankheit 1,2 regulieren. Obwohl bekannt ist, dass Mitglieder der Caspase-Familie bei einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen induziert werden, ist es schwieriger zu verstehen, welche Caspase die Krankheitspathologie antreibt3. Solche Studien erfordern Werkzeuge, um die Funktion einzelner Caspase-Familienmitglieder zu identifizieren, zu charakterisieren und zu validieren. Die Analyse der relevanten einzelnen Caspasen ist sowohl aus mechanistischer als auch aus therapeutischer Sicht wichtig, da die Literatur mehrere Studien enthält, die die vielfältigen Rollen von Caspasen belegen 4,5. Wenn das Ziel also darin besteht, eine Caspase bei einer Krankheit für einen therapeutischen Nutzen zu nutzen, ist es wichtig, die relevanten Familienmitglieder gezielt anzusprechen. Traditionelle Techniken zum Nachweis von Caspase-Spiegeln im Gewebe umfassen Western Blotting und enzymatische und fluorometrische Ansätze 3,6. Keine dieser Maßnahmen ermöglicht jedoch einen zellspezifischen Nachweis von Caspase-Spiegeln, und in einigen Szenarien können gespaltene Caspasen oft nicht durch herkömmliche Proteinanalysemaßnahmen nachgewiesen werden. Es ist bekannt, dass Caspasen unterschiedliche apoptotische und nicht-apoptotische Rollen im selben Gewebe spielen können7, daher ist eine sorgfältige Charakterisierung der zellspezifischen Caspase-Spiegel erforderlich, um die Entwicklungs- und Krankheitswege genau zu verstehen.
Diese Studie zeigt die Aktivierung und Funktion von Caspase in einem Modell der neurovaskulären Hypoxie-Ischämie – retinale Venenokklusion (RVO)7,8. In einem komplexen Gewebe wie der Netzhaut gibt es mehrere Zelltypen, die von der bei RVO induzierten Hypoxie-Ischämie betroffen sein können, einschließlich Gliazellen, Neuronen und Gefäßsystem7. In der adulten Netzhaut der Maus gibt es sehr wenig Expression von Caspasen in gesundem Gewebe, gemessen durch Immunhistochemie (IHC)7, aber das ist nicht der Fall während der Entwicklung9 oder in Modellen der Netzhauterkrankung10,11. IHC ist eine Technik, die in der biomedizinischen Forschung gut etabliert ist und die Validierung von Krankheits- und pathologischen Zielen, die Identifizierung neuer Rollen durch räumliche Lokalisierung und die Quantifizierung von Proteinen ermöglicht hat. In Fällen, in denen gespaltene Caspase-Produkte nicht durch Western Blot oder fluorometrische Analyse nachgewiesen werden können, noch die spezifische Zellposition verschiedener Caspasen oder die Abfrage von Caspase-Signalwegen durch Lokalisierung, sollte IHC verwendet werden.
Um die Caspase(n) funktionell relevant in RVO zu bestimmen, wurde IHC mit validierten Antikörpern für Caspasen und zelluläre Marker verwendet. Die früheren Studien, die im Labor durchgeführt wurden, zeigten, dass Caspase-9 in einem Modell des ischämischen Schlaganfalls und der Hemmung von Caspase-9 mit einem hochspezifischen Inhibitor, der vor neuronaler Dysfunktion und Tod geschützt war, schnell aktiviert wurde12. Da die Netzhaut Teil des zentralen Nervensystems (ZNS) ist, dient sie als Modellsystem, um die Rolle von Caspase-9 bei neurovaskulären Verletzungen abzufragen und weiter zu untersuchen13. Zu diesem Zweck wurde das Mausmodell von RVO verwendet, um die zellspezifische Lage und Verteilung von Caspase-9 und seine Bedeutung für neurovaskuläre Verletzungen zu untersuchen. RVO ist eine häufige Ursache für Erblindung bei Erwachsenen im erwerbsfähigen Alter, die auf eine Gefäßverletzung zurückzuführenist 14. Es wurde festgestellt, dass Caspase-9 in Endothelzellen nicht-apoptotisch exprimiert wurde, aber nicht in Neuronen.
Als Gewebe hat die Netzhaut den Vorteil, dass sie entweder als Flatmount visualisiert wird, was eine Wahrnehmung der vaskulären Netzwerke ermöglicht, oder als Querschnitte, die die neuronalen Netzhautschichten hervorheben. Die Quantifizierung der Caspase-Proteinexpression in Querschnitten liefert den Kontext, welcher Caspase potenziell entscheidend für die neuronale Konnektivität und Sehfunktion der Netzhaut ist, indem die Lokalisation der Caspase(n) in der Netzhaut identifiziert wird. Nach der Identifizierung und Validierung wird das Targeting der interessierenden Caspase durch induzierbare zellspezifische Deletion der identifizierten Caspase erreicht. Für mögliche therapeutische Fragestellungen wurde die Relevanz der interessierenden Caspasen mit spezifischen Werkzeugen zur Hemmung der aktivierten Caspase getestet. Für Caspase-9 wurde ein zellpermierter hochselektiver Inhibitor 7,15, Pen1-XBIR3 verwendet. Für diesen Bericht wurden 2 Monate alter, männlicher C57BL/6J-Stamm und Tamoxifen-induzierbarer endothelialer Caspase-9-Knockout-Stamm (iEC Casp9KO) mit einem C57BL/6J-Hintergrund verwendet. Diese Tiere wurden dem Mausmodell von RVO ausgesetzt und C57BL/6J wurde mit dem selektiven Caspase-9-Inhibitor Pen1-XBir3 behandelt. Die beschriebene Methodik kann auf andere Krankheitsmodelle im zentralen und peripheren System angewendet werden 7,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Caspasen sind eine mehrgliedrige Familie von Proteasen, die am besten auf ihre Rolle beim Zelltod und der Entzündung untersucht werden. In jüngerer Zeit wurden jedoch für einige Familienmitglieder eine Vielzahl von Nicht-Todesfall-Funktionen aufgedeckt 4,5. Ein Großteil unseres Verständnisses der Caspase-Funktion stammt aus der Arbeit in Zellkultur und aus Inferenzdaten menschlicher Erkrankungen. Während es geschätzt wird, dass es eine aberrante Induktion,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) Stipendium DGE – 1644869 und das National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) der National Institutes of Health (NIH), Preisnummer F99NS124180 NIH NINDS Diversity Specialized F99 (an CKCO), das National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (an AMP), das National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 an CMT) und das Department of Defense Army/Air Force (DURIP an CMT).
Materials
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
| Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | open source | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Forcep | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Perfusion pump | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
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