Detección de intermediarios de recombinación homóloga mediante ligadura de proximidad y PCR cuantitativa en Saccharomyces cerevisiae

Summary

Los ensayos de captura de bucle D (DLC) y extensión de bucle D (DLE) utilizan el principio de ligadura de proximidad junto con PCR cuantitativa para cuantificar la formación de bucle D, la extensión del bucle D y la formación de productos en el sitio de una ruptura ducible de doble cadena en Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

El daño del ADN, incluidas las roturas de doble cadena del ADN y los enlaces cruzados entre cadenas, incurridos durante las fases S y G2 del ciclo celular pueden repararse mediante recombinación homóloga (HR). Además, HR representa un mecanismo importante de rescate de la bifurcación de replicación después de un estancamiento o colapso. La regulación de los muchos pasos reversibles e irreversibles de esta compleja vía promueve su fidelidad. El análisis físico de los intermedios de recombinación formados durante la FC permite la caracterización de estos controles por diversos factores de nucleoproteínas y sus interactores. Aunque existen métodos bien establecidos para evaluar eventos específicos e intermedios en la vía de recombinación, la detección de la formación y extensión del bucle D, dos pasos críticos en esta vía, ha demostrado ser un desafío hasta hace poco. Aquí, se describen métodos eficientes para detectar eventos clave en la vía HR, a saber, la formación de rotura de doble cadena de ADN, la formación de bucle D, la extensión del bucle D y la formación de productos a través de la replicación inducida por rotura (BIR) en Saccharomyces cerevisiae . Estos ensayos detectan sus intermedios de recombinación relevantes y productos con alta sensibilidad y son independientes de la viabilidad celular. La detección de D-loops, extensión D-loop y el producto BIR se basa en la ligadura de proximidad. Juntos, estos ensayos permiten el estudio de la cinética de la FC a nivel de la población para abordar con precisión las funciones de las proteínas y reguladores de la FC en pasos significativos en la vía.

Introduction

La recombinación homóloga (HR) es un mecanismo de alta fidelidad de reparación de roturas bicatenarias de ADN (DSB), enlaces cruzados entre cadenas y brechas de ssDNA, así como una vía para la tolerancia al daño del ADN. La FC difiere de las vías propensas a errores para la reparación/tolerancia al daño del ADN, como la unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la síntesis de translesiones, en que utiliza un ADN dúplex homólogo intacto como donante para modelar el evento de reparación. Además, muchos de los intermedios clave en la vía de FC son reversibles, lo que permite una regulación exquisita de los pasos individuales de la vía. Durante las fases S, G2 y M del ciclo celular, HR compite con NHEJ para la reparación de los DSB de dos extremos¹. Además, la FC es esencial para la replicación del ADN para la reparación del daño del ADN asociado a la replicación, incluidas las brechas de ssDNA y los DSB unilaterales, y como mecanismo de derivación de la lesión del ADN².

Un intermediario crítico en la vía HR es el bucle de desplazamiento, o bucle D (Figura 1). Después de la resección final, la recombinasa central en la reacción, Rad51, se carga sobre el ssDNA recién resecado de la molécula rota, formando un filamento helicoidal². Rad51 luego lleva a cabo una búsqueda de homología para identificar un donante homólogo adecuado, típicamente la cromátida hermana en células somáticas. El D-loop se forma cuando el filamento Rad51-ssDNA invade un ADN dúplex homólogo, lo que conduce al emparejamiento de la base Watson-Crick de la hebra rota con la hebra complementaria del donante, desplazando la hebra donante opuesta. La extensión del extremo 3′ de la hebra rota por una ADN polimerasa reemplaza las bases que se perdieron durante el evento de daño del ADN y promueve la resolución del intermedio de bucle D extendido en un producto de dsDNA a través del recocido de hebra dependiente de la síntesis (SDSA), la unión de doble Holliday (dHJ) o las subvías HR de replicación inducida por rotura (BIR).

Los ensayos que monitorean físicamente los intermediarios en la vía HR permiten el análisis de los requisitos genéticos para cada paso (es decir, análisis de vía). La formación de DSB, la resección final, las dHJ, las burbujas de replicación BIR y los productos HR se observan fácilmente mediante Southern blotting 3,4,5,6,7. Sin embargo, Southern blotting no informa sobre los bucles D nacientes y extendidos y, por lo tanto, se requiere un método alternativo para medir de manera confiable estas moléculas conjuntas ^4,8,9. Una estrategia ampliamente utilizada para analizar la formación naciente del bucle D es la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de Rad51 junto con la PCR cuantitativa (qPCR)^10,11. Sin embargo, la asociación de Rad51 con dsDNA medida por ChIP-qPCR es independiente de la homología de secuencia y del factor accesorio Rad51 Rad54^10,11. En contraste, una señal apreciable utilizando el método de análisis de bucle D presentado aquí, llamado ensayo de captura de bucle D (DLC), depende de la formación de DSB, homología de secuencia, Rad51 y las proteínas accesorias Rad51 Rad52 y Rad54⁸. El hallazgo de que la formación del bucle D promovido por Rad51 por Saccharomyces cerevisiae depende de Rad54 in vivo está de acuerdo con numerosos experimentos de reconstitución in vitro que indican que Rad54 es necesario para la búsqueda de homología y la formación del bucle D por la levadura en ciernes Rad51 8,12,13,14,15.

Los enfoques actuales para medir la extensión del bucle D, principalmente a través de PCR semicuantitativa, son igualmente problemáticos. Un ensayo típico basado en PCR para detectar la extensión del bucle D amplifica una secuencia única, resultante de la recombinación entre un sitio de ruptura y un donante ectópico y la posterior síntesis de ADN asociada a la recombinación, a través de un cebador aguas arriba de la región de homología en la hebra rota y otro cebador aguas abajo de la región de homología en la cadena donante. Utilizando este método, la detección de la síntesis de ADN asociada a la recombinación requiere el factor de procesividad Pol δ no esencial Pol32¹⁶. Este hallazgo entra en conflicto con la observación de que la eliminación de POL32 tiene solo un efecto leve sobre la conversión génica in vivo¹⁷. Además, estos ensayos basados en PCR no logran resolver temporalmente la extensión del bucle D y la formación del producto BIR, lo que sugiere que la señal resulta de productos de dsDNA en lugar de intermedios de ssDNA^17,18,19. El ensayo de extensión de bucle D (DLE) se desarrolló recientemente para abordar estas discrepancias. El ensayo DLE cuantifica la síntesis de ADN asociada a la recombinación en un sitio ~ 400 pares de bases (pb) aguas abajo del extremo invasor inicial³‘ 9. Mediante este método, la extensión del bucle D es independiente de Pol32 y es detectable dentro de las 4 h posteriores a la inducción DSB, mientras que los productos BIR se observan por primera vez a las 6 h. De hecho, una publicación reciente de los laboratorios Haber y Malkova señaló que el uso de este método de preparación de ADN genómico resulta singularmente en la preservación del ssDNA ^9,20.

Aquí, los ensayos DLC y DLE se describen en detalle. Estos ensayos se basan en la ligadura de proximidad para detectar bucles D nacientes y extendidos en S. cerevisiae (Figura 2)^8,9. Los productos BIR se pueden cuantificar utilizando este mismo sistema de ensayo. Para ambos ensayos, la formación de DSB en un sitio de corte de endonucleasa HO ubicado en el locus URA3 en el cromosoma (Chr.) V es inducida por la expresión de la endonucleasa HO bajo el control de un promotor inducible por galactosa. La invasión de la cadena de ADN mediada por Rad51 conduce a la formación naciente del bucle D en el sitio de un donante ectópico ubicado en el locus LYS2 en Chr. II. Como el lado derecho del DSB carece de homología con el donante, la reparación a través de SDSA y la formación de dHJ no es factible. La reparación inicial del DSB por BIR es posible, pero la formación de productos viables es inhibida por la presencia del centrómero²¹. Este diseño deliberado impide la reparación productiva de DSB, evitando así la reanudación del crecimiento de las células con DBS reparadas, que de otro modo podrían superar el cultivo durante el análisis del curso del tiempo.

En el ensayo DLC, la reticulación de psoraleno de las dos hebras del ADN heterodúplex dentro del bucle D preserva el intermedio de recombinación. Después de la restauración del sitio de la enzima de restricción en la hebra rota (resecada) y la digestión, la reticulación permite la ligadura de las secuencias únicas aguas arriba de los ADN rotos homólogos y donantes. Usando qPCR, se cuantifica el nivel de molécula de ADN quimérico presente en cada muestra. En el ensayo DLE, no se requiere reticulación, y la restauración del sitio de la enzima de restricción y la digestión seguida de la ligadura intramolecular en su lugar vinculan el extremo 5′ de la molécula rota al extremo 3′ recién extendido. Una vez más, la qPCR se utiliza para cuantificar las cantidades relativas de este producto quimérico en cada muestra. En ausencia de restauración del sitio de la enzima de restricción, el ensayo DLE informa sobre los niveles relativos del producto BIR (dsDNA) que se forma después de la extensión del bucle D.

Se muestran los resultados representativos de cada ensayo con una cepa de tipo salvaje, y los lectores son remitidos a Piazza et al.8 y Piazza et al.9 para el uso de estos ensayos para el análisis de mutantes de recombinación ^8,9. La intención de esta contribución es permitir que otros laboratorios adopten los ensayos DLC y DLE, y el soporte para ellos está disponible a pedido.

Protocol

1. Precrecimiento, inducción DSB y recolección de muestras NOTA: Se recomienda la suplementación de todos los medios con 0,01% de adenina para las cepas de Ade. Rayar las cepas haploides apropiadas (ver Tabla 1) en levadura peptona dextrosa adenina (YPDA) ( 1% extracto de levadura, 2% peptona, 2% glucosa, 2% agar, 0,001% adenina) y crecer durante 2 días a 30 °C. Use una sola colonia para inocular 5 ml de YPDA en un tubo de cultivo de v…

Representative Results

Ensayo DLCEl ensayo DLC detecta bucles D nacientes y extendidos formados por la invasión de un DSB específico del sitio en un solo donante (Figura 2). La reticulación del psoraleno une físicamente la hebra rota y el donante a través del ADN heterodúplex dentro del bucle D. La restauración del sitio de la enzima de restricción con un oligo hibridante largo en la hebra resecada de la ruptura permite la escisión de la enzima de restricción, seguida de la …

Discussion

Los ensayos presentados permiten la detección de bucles D nacientes y extendidos (ensayo DLC), extensión de bucle D (ensayo DLE) y formación de productos BIR (ensayo DLE sin oligonucleótidos hibridantes) utilizando ligadura de proximidad y qPCR. La ChIP-qPCR de Rad51 a sitios distantes del DSB se ha utilizado previamente como un proxy para la búsqueda de homología mediada por Rad51 y la formación de bucle D. Sin embargo, esta señal ChIP-qPCR es independiente de la homología de secuencia entre el sitio de ruptura…

Materials

1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom			Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker			Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrup	Sigma-Aldrich	L1375	For media preparation
Agar	Fisher	BP1423500	For media preparation
Bacto peptone	BD Difco	211840	For media preparation
Bacto yeast extract	BD Difco	212750	For media preparation
D-(+)-glucose	BD Difco	0155-17-4	For media preparation
Trioxsalen	Sigma-Aldrich	T6137	For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100T	US Biological	Z1004	For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HF	New England Biolabs	R3101	Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HF	New England Biolabs	R3104	Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202	Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1	Sigma-Aldrich	P2069	DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480	Roche	5015278001	qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96	Roche	5815916001	qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, white	Roche	4729692001	96-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix	BioRad	1725271	qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master Mix	Roche	4707516001	qPCR kit used by the authors