الكشف عن وسيطة إعادة التركيب المتماثلة عن طريق ربط القرب و PCR الكمي في Saccharomyces cerevisiae
Summary
تستخدم مقايسات التقاط الحلقة D (DLC) وامتداد الحلقة D (DLE) مبدأ ربط القرب مع تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لتحديد تكوين الحلقة D وتمديد الحلقة D وتشكيل المنتج في موقع كسر مزدوج تقطعت به السبل في Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
يمكن إصلاح تلف الحمض النووي ، بما في ذلك فواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل والوصلات المتقاطعة بين الخيوط ، والتي تحدث خلال مرحلتي S و G2 من دورة الخلية عن طريق إعادة التركيب المتماثل (HR). بالإضافة إلى ذلك ، تمثل الموارد البشرية آلية مهمة لإنقاذ شوكة النسخ المتماثل بعد التوقف أو الانهيار. إن تنظيم العديد من الخطوات القابلة للعكس والتي لا رجعة فيها لهذا المسار المعقد يعزز إخلاصه. يتيح التحليل الفيزيائي لوسيطات إعادة التركيب التي تشكلت أثناء الموارد البشرية توصيف هذه الضوابط بواسطة عوامل البروتين النووي المختلفة وتفاعلاتها. على الرغم من وجود طرق راسخة لفحص أحداث ووسيطات محددة في مسار إعادة التركيب ، إلا أن اكتشاف تكوين الحلقة D وتمديدها ، وهما خطوتان حاسمتان في هذا المسار ، أثبت أنه يمثل تحديا حتى وقت قريب. هنا ، يتم وصف طرق فعالة للكشف عن الأحداث الرئيسية في مسار الموارد البشرية ، وهي تشكيل كسر الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل ، وتشكيل الحلقة D ، وتمديد الحلقة D ، وتشكيل المنتجات عن طريق النسخ المتماثل الناجم عن الكسر (BIR) في Saccharomyces cerevisiae . تكتشف هذه المقايسات وسيطة إعادة التركيب ذات الصلة والمنتجات ذات الحساسية العالية ومستقلة عن الجدوى الخلوية. يعتمد اكتشاف الحلقات D وامتداد الحلقة D ومنتج BIR على ربط القرب. تسمح هذه المقايسات معا بدراسة حركية الموارد البشرية على مستوى السكان لمعالجة وظائف بروتينات الموارد البشرية والمنظمين بدقة في خطوات مهمة في المسار.
Introduction
إعادة التركيب المتماثل (HR) هي آلية عالية الدقة لإصلاح فواصل الحمض النووي المزدوجة (DSBs) ، والوصلات المتقاطعة بين الخيوط ، وفجوات ssDNA ، بالإضافة إلى مسار لتحمل تلف الحمض النووي. يختلف HR عن المسارات المعرضة للخطأ لإصلاح / تحمل تلف الحمض النووي ، مثل الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) وتوليف الآفة ، من حيث أنه يستخدم الحمض النووي المزدوج المتماثل السليم كمتبرع لقالب حدث الإصلاح. علاوة على ذلك ، فإن العديد من الوسائط الرئيسية في مسار الموارد البشرية قابلة للعكس ، مما يسمح بتنظيم رائع لخطوات المسار الفردية. خلال المراحل S و G2 و M من دورة الخلية ، تتنافس HR مع NHEJ لإصلاح DSBs1 ذات النهايات. بالإضافة إلى ذلك ، يعد HR ضروريا لتكرار الحمض النووي لإصلاح تلف الحمض النووي المرتبط بالنسخ المتماثل ، بما في ذلك فجوات ssDNA و DSBs أحادية الجانب ، وكآلية لتجاوز آفة الحمض النووي2.
الوسيط الحرج في مسار الموارد البشرية هو حلقة الإزاحة ، أو الحلقة D (الشكل 1). بعد الاستئصال النهائي ، يتم تحميل recombinase المركزي في التفاعل ، Rad51 ، على ssDNA المستقطع حديثا للجزيء المكسور ، مكونا خيطا حلزونيا2. ثم يقوم Rad51 بإجراء بحث تماثلي لتحديد متبرع متماثل مناسب ، عادة ما يكون الكروماتيد الشقيق في الخلايا الجسدية. تتشكل الحلقة D عندما يغزو خيط Rad51-ssDNA الحمض النووي المزدوج المتماثل ، مما يؤدي إلى اقتران قاعدة Watson-Crick للشريط المكسور مع الشريط المكمل للمتبرع ، مما يؤدي إلى إزاحة شريط المتبرع المقابل. يستبدل تمديد الطرف 3 ‘من الشريط المكسور بواسطة بوليميراز الحمض النووي القواعد التي فقدت أثناء حدث تلف الحمض النووي ويعزز حل وسيط الحلقة D الممتد إلى منتج dsDNA من خلال تلدين الشريط المعتمد على التوليف (SDSA) ، أو تقاطع هوليداي المزدوج (dHJ) ، أو المسارات الفرعية HR للتكرار الناجم عن الكسر (BIR).
تسمح الفحوصات التي تراقب فعليا المواد الوسيطة في مسار الموارد البشرية بتحليل المتطلبات الجينية لكل خطوة (أي تحليل المسار). يتم ملاحظة تكوين DSB ، والاستئصال النهائي ، و dHJs ، وفقاعات تكرار BIR ، ومنتجات الموارد البشرية بسهولة بواسطة النشاف الجنوبي3،4،5،6،7. ومع ذلك ، فشل النشاف الجنوبي في الإبلاغ عن حلقات D الناشئة والممتدة ، وبالتالي ، يلزم وجود طريقة بديلة لقياس جزيئات المفاصل هذه بشكل موثوق4،8،9. إحدى الاستراتيجيات المستخدمة على نطاق واسع لتحليل تكوين الحلقة D الوليدة هي الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) ل Rad51 إلى جانب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) 10,11. ومع ذلك ، فإن ارتباط Rad51 مع dsDNA كما تم قياسه بواسطة ChIP-qPCR مستقل عن تماثل التسلسل وعامل ملحق Rad51 Rad5410,11. في المقابل ، تعتمد الإشارة الملموسة باستخدام طريقة تحليل الحلقة D المعروضة هنا ، والتي تسمى مقايسة التقاط الحلقة D (DLC) ، على تكوين DSB ، وتماثل التسلسل ، و Rad51 ، وبروتينات ملحق Rad51 Rad52 و Rad548. إن اكتشاف أن تكوين حلقة D المروج ل Saccharomyces cerevisiae Rad51 يعتمد على Rad54 في الجسم الحي يتفق مع العديد من تجارب إعادة التكوين في المختبر التي تشير إلى أن Rad54 مطلوب للبحث عن التماثل وتشكيل حلقة D بواسطة الخميرة الناشئة Rad518،12،13،14،15.
النهج الحالية لقياس امتداد الحلقة D ، في المقام الأول من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل شبه الكمي ، هي إشكالية بالمثل. تعمل المقايسة النموذجية القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل للكشف عن امتداد الحلقة D على تضخيم تسلسل فريد ، ناتج عن إعادة التركيب بين موقع الكسر والمتبرع خارج الرحم وتخليق الحمض النووي المرتبط بإعادة التركيب اللاحق ، عبر تمهيدي في المنبع لمنطقة التماثل على الشريط المكسور والتمهيدي الآخر في اتجاه مجرى منطقة التماثل على الشريط المانح. باستخدام هذه الطريقة ، يتطلب الكشف عن تخليق الحمض النووي المرتبط بإعادة التركيب عامل معالجة Pol δ غير الأساسي Pol3216. تتعارض هذه النتيجة مع ملاحظة أن حذف POL32 له تأثير خفيف فقط على تحويل الجينات في الجسم الحي17. علاوة على ذلك ، تفشل هذه المقايسات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل في حل امتداد الحلقة D وتشكيل منتج BIR مؤقتا ، مما يشير إلى أن الإشارة تنتج عن منتجات dsDNA بدلا من وسيطة ssDNA17،18،19. تم تطوير مقايسة تمديد الحلقة D (DLE) مؤخرا لمعالجة هذه التناقضات. يحدد اختبار DLE تخليق الحمض النووي المرتبط بإعادة التركيب في موقع ~ 400 زوج أساسي (bp) في اتجاه مجرى النهر من النهاية الغازية الأولية3 ‘9. بهذه الطريقة ، يكون امتداد الحلقة D مستقلا عن Pol32 ويمكن اكتشافه في غضون 4 ساعات بعد تحريض DSB ، بينما يتم ملاحظة منتجات BIR لأول مرة في 6 ساعات. في الواقع ، أشار منشور حديث من مختبرات هابر ومالكوفا إلى أن استخدام هذه الطريقة في تحضير الحمض النووي الجينومي يؤدي بشكل فريد إلى الحفاظ على ssDNA 9,20.
هنا ، يتم وصف مقايسات DLC و DLE بالتفصيل. تعتمد هذه المقايسات على ربط القرب للكشف عن حلقات D الناشئة والممتدة في S. cerevisiae (الشكل 2) 8,9. يمكن قياس كمية منتجات BIR باستخدام نفس نظام المقايسة. بالنسبة لكلا الفحصين ، يتم تحفيز تكوين DSB في موقع قطع نوكلياز HO الموجود في موضع URA3 على الكروموسوم (Chr.) V من خلال التعبير عن نوكلياز HO تحت سيطرة مروج محفز للجالاكتوز. يؤدي غزو حبلا الحمض النووي بوساطة Rad51 إلى تكوين حلقة D ناشئة في موقع متبرع خارج الرحم يقع في موضع LYS2 في Chr. II. نظرا لأن الجانب الأيمن من DSB يفتقر إلى التماثل مع المتبرع ، فإن الإصلاح عبر SDSA وتشكيل dHJ غير ممكن. من الممكن إجراء إصلاح أولي لجهاز DSB بواسطة BIR ، ولكن يتم تثبيط تكوين منتجات قابلة للحياة من خلال وجود centromere21. يمنع هذا التصميم المتعمد إصلاح DSB الإنتاجي ، وبالتالي تجنب استئناف النمو بواسطة الخلايا ذات DBSs التي تم إصلاحها ، والتي يمكن أن تتجاوز الثقافة أثناء تحليل الدورة الزمنية.
في مقايسة DLC ، يحافظ تشابك السورالين لشريطي الحمض النووي غير المتجانس داخل الحلقة D على وسيط إعادة التركيب. بعد استعادة موقع إنزيم التقييد على الشريط المكسور (المستأصل) والهضم ، يسمح التشابك بربط التسلسلات الفريدة في المنبع للحمض النووي المتماثل المكسور والمتبرع. باستخدام qPCR ، يتم تحديد مستوى جزيء الحمض النووي الخيمري الموجود في كل عينة. في فحص DLE ، لا يلزم التشابك ، واستعادة موقع إنزيم التقييد والهضم متبوعا بالربط داخل الجزيئات بدلا من ذلك يربط نهاية 5 ‘من الجزيء المكسور بنهاية 3’ الممتدة حديثا. مرة أخرى ، يتم استخدام qPCR لتحديد الكميات النسبية لهذا المنتج الوهمي في كل عينة. في حالة عدم استعادة موقع إنزيم التقييد ، يبلغ اختبار DLE عن المستويات النسبية لمنتج BIR (dsDNA) الذي يتم تشكيله بعد تمديد الحلقة D.
يتم عرض النتائج التمثيلية لكل اختبار باستخدام سلالة من النوع البري ، ويتم إحالة القراء إلى Piazza et al.8 و Piazza et al.9 لاستخدام هذه المقايسات لتحليل طفرات إعادة التركيب 8,9. الغرض من هذه المساهمة هو تمكين المختبرات الأخرى من اعتماد مقايسات DLC و DLE ، والدعم متاح عند الطلب.
Protocol
Representative Results
Discussion
تسمح المقايسات المقدمة بالكشف عن حلقات D الناشئة والممتدة (مقايسة DLC) ، وتمديد الحلقة D (مقايسة DLE) ، وتشكيل منتج BIR (مقايسة DLE بدون تهجين قليل النيوكليوتيدات) باستخدام ربط القرب و qPCR. تم استخدام ChIP-qPCR ل Rad51 إلى مواقع بعيدة عن DSB سابقا كوكيل للبحث عن التماثل بوساطة Rad51 وتشكيل الحلقة D. ومع ذلك ، فإن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم العمل في مختبر هاير من خلال المنح GM58015 و GM137751 إلى W.-D.H. يتم دعم البحث في مختبر Piazza من قبل مجلس البحوث الأوروبي (ERC-StG 3D-loop ، الاتفاقية الكبرى 851006). يتم دعم D.R. من قبل T32CA108459 ومؤسسة AP Giannini. نشكر Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) على مشاركة نتائج فحص DLC / DLE الخاصة به وللتحقق من صحة التغييرات التي تم إجراؤها على المقايسات المفصلة في هذا البروتوكول.
Materials
| 1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection | |||
| Equipment | |||
| 15 and 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL glass culture tubes | |||
| 250 mL, 500 mL, or 1 L flasks | |||
| 60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom | Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G | ||
| Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters | |||
| Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver | |||
| Rotator | |||
| UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker | Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831 | ||
| Materials | |||
| 60% w/w sodium DL-lactate syrup | Sigma-Aldrich | L1375 | For media preparation |
| Agar | Fisher | BP1423500 | For media preparation |
| Bacto peptone | BD Difco | 211840 | For media preparation |
| Bacto yeast extract | BD Difco | 212750 | For media preparation |
| D-(+)-glucose | BD Difco | 0155-17-4 | For media preparation |
| Trioxsalen | Sigma-Aldrich | T6137 | For psoralen cross-linking |
| 2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration | |||
| Supplies | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
| Dry bath | |||
| Liquid nitrogen or dry ice/ethanol | |||
| Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge | |||
| Materials | |||
| 10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0) | |||
| Zymolyase 100T | US Biological | Z1004 | For spheroplasting |
| 3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation | |||
| Supplies | |||
| Water bath | |||
| Materials | |||
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101 | Restriction enzyme digest for DLC assay |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104 | Restriction enzyme digest for DLE assay |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Intramolecular ligation |
| 4. DNA purification | |||
| Supplies | |||
| 1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes | |||
| Materials | |||
| Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 | Sigma-Aldrich | P2069 | DNA purification |
| 5. Psoralen cross-link reversal | |||
| Supplies | |||
| Thermocycler/PCR machine | |||
| 6. qPCR | |||
| Supplies | |||
| Lightcycler 480 | Roche | 5015278001 | qPCR machine used by the authors |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR machine used by the authors |
| Materials | |||
| LightCycler 480 96-Well Plate, white | Roche | 4729692001 | 96-well plates for qPCR |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix | BioRad | 1725271 | qPCR kit used by the authors |
| SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | qPCR kit used by the authors |
References
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).
- Heyer, W. -. D. Regulation of recombination and genomic maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501 (2015).
- Mimitou, E. P., Symington, L. S. Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing. Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).
- Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair. Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).
- Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins. Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).
- Mazón, G., Symington, L. S. Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates. Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).
- Saini, N., et al. Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis. Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).
- Piazza, A., et al. Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair. Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).
- Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -. D. A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae. Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).
- Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination. Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).
- Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo. Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).
- Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins. Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).
- Wright, W. D., Heyer, W. -. D. Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation. Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).
- Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -. D., Cam, E. L., Dupaigne, P. In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation. Nature Communications. 10 (1), 4058 (2019).
- Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).
- Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32. Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).
- Jain, S., et al. A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair. Genes & Development. 23 (3), 291-303 (2009).
- Donnianni, R. A., Symington, L. S. Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).
- Liu, L., et al. Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks. Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).
- Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER). Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).
- Pham, N., et al. Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks. The EMBO Journal. 40 (10), 104847 (2021).
- Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).
- Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion. Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).
- Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).
- Prakash, R., et al. Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination. Genes & Development. 23 (1), 67-79 (2009).
- Liu, J., et al. Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase δ-extending D-loops. eLife. 6, 22195 (2017).
- Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -. D. Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism. Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).
- Shah, S. S., Hartono, S. R., Chédin, F., Heyer, W. -. D. Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution. eLife. 9, 59111 (2020).
